崔艳婷 谢小红⋆ 顾锡冬 胡袁媛 周长玉

近年来乳腺癌的发病率和病死率呈现明显上升趋势。肿瘤的浸润和转移是肿瘤治疗的最大障碍和直接导致患者死亡的主要原因［1］。血管新生与实体瘤的生长、浸润、转移及预后密切相关，已成为肿瘤治疗的新靶点之一［2］。微血管密度（MVD）是目前用以衡量肿瘤新生血管程度的常用标志［3］，可作为判定原发肿瘤生物学侵袭性和转移潜能的指标。血管内皮生长因子（VEGF）可以刺激肿瘤新生血管形成，在乳腺癌的侵袭和转移中发挥着重要作用。本文分析乳腺癌组织中MVD、VEGF的表达与乳腺癌Ki-67、淋巴结转移等临床病理学特征的相关性，为乳腺癌临床治疗及预后判断提供参考。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2016年6月至2017年5月浙江省中医院乳腺病中心乳腺癌患者120例，所有患者均在B超引导下麦默通穿刺活检病理证实为乳腺癌，其中浸润性导管癌108例、导管内癌8例、黏液癌3例、小叶癌1例，为排除不同病理类型乳腺癌间的相互干扰，选取样本量较大的108例浸润性导管癌，均为女性，患者年龄25～83岁，平均年龄51岁。其中Ki-67低表达47例、高表达61例。有淋巴结转移51例、无淋巴结转移57例。所有患者取得完整免疫组化及FISH报告结果，未接受任何治疗。

1.2 方 法 MVD、VEGF、Ki-67、ER、PR、HER-2免抗人单克隆抗体均购自北京中杉公司，选取108例乳腺癌组织标本，所有标本均用10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，制备4μm厚连续切片，对每例切片分别进行ER、PR、HER-2、Ki-67、VEGF、MVD免疫组化染色，采用SP免疫组化法严格按照说明书的步骤操作进行，并进行常规的HE染色。

1.3 结果判定 （1）MVD判定标准：采用国际常用的Weidner改进式方法测量，先于低倍镜下（×100）观察整个玻片，确定MVD最大的热点区域后，再于高倍镜下（×200）观察并计数。MVD计数以肿瘤血管内皮细胞胞质或胞膜上呈现棕黄色为阳性标准，每个染为棕色的可与周围血管、肿瘤细胞及其结缔组织分开的内皮细胞或内皮细胞簇，无论是否形成管腔，均作为一个可计数的微血管。记录5个高倍视野内的微血管数，取其平均数作为该肿瘤的MVD值。（2）VEGF判定标准：VEGF蛋白阳性表达部位为细胞浆，判读结果按照阳性细胞百分比计分和染色强度计分的乘积作为最后计分。按照阳性细胞百分比分为：＜5%为0分，6%～25% 为 1分，26%～50% 为 2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。按染色强度计分：无染色为0分，淡黄色1分，黄色1分，棕黄色3分。得两者乘积 ：0 分为（-），1～4 分为（+），5～8 分（++），9～12分（+++）。将（-）和（+）定为低表达，将（++）和（+++）定为高表达。（3）Ki-67判定标准：通过光学显微镜观察，随机计数10个高倍视野阳性肿瘤细胞占肿瘤细胞总数的百分比，即Ki-67增殖指数。参考2013年美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理学家学会（CAP）推荐标准［4］，棕黄色颗粒＜10%定为（-），10%～29%为（+），30%～49%为（++），＞50%为（+++）。将（-）和（+）定为低表达，将（++）和（+++）定为高表达。（4）ER、PR判定标准：无反应或＜10%肿瘤细胞膜染色定义为阴性，≥10%定义为阳性。（5）HER-2判定标准：细胞膜呈棕黄色为阳性。无细胞染色为（-）；任何比例的浸润癌细胞呈微弱、不完整的细胞膜着色为（+）；＞10%的浸润癌细胞呈弱至中等强度、完整但不均匀的细胞膜棕黄色着色，或＜30%的浸润性癌细胞呈强且完整的细胞膜棕褐色着色为（++）；＞30%的浸润癌细胞呈强的、完整的细胞膜棕褐色着色为（+++）。均行FISH检测，根据结果判定FISH（-）为HER-2阴性，FISH（+）为HER-2阳性。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。其中计量资料用（x±s）表示，用t检验；计数资料用χ2检验；两变量资料相关性用Spearman分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺浸润性导管癌中 MVD、VEGF、Ki-67、ER、PR、HER-2的表达情况 MVD计数最小值为10，最大值为43，均值为（22.85±8.063），VEGF、Ki-67阳性高表达率为56.5%、68.5%，ER、PR、HER-2阳性表达率分别为64.8%、59.3%、38.0%。

2.2 MVD计数与乳腺浸润性导管癌临床病理学特征的关系 见表1。

表1 MVD分布与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系

2.3 VEGF表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系 见表2。

表2 VEGF表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系

2.4 乳腺浸润性导管癌中MVD与VEGF的关系 根据乳腺浸润性导管癌中MVD均值为（22.85±8.063），以22为界，＞22为MVD高表达，≤22为MVD低表达。乳腺浸润性导管癌中MVD与VEGF呈正相关，差异有统计学意义（r=0.481，P＜0.00）。见表3。

表3 乳腺浸润性导管癌中VEGF表达与MVD分布的关系

3 讨论

研究表明，肿瘤从血管前期的静止状态发展到伴随肿瘤血管新生的浸润状态，需要突破血管再生调控刺激因子作用的平衡［5-6］。当肿瘤组织内的血管生成刺激因子作用处于上调状态，血管生成抑制因子作用处于下调状态，血管生成作用机制则处于“开启”状态，即出现肿瘤血管新生［5-6］。

MVD被认为是反映肿瘤血管生成的最有效的客观指标［7］。研究表明，MVD与肿瘤的生长、转移、预后密切相关，可作为乳腺癌预后判断的一个独立指标。本资料中，淋巴结转移组的MVD值（24.75±8.421）高于无淋巴结转移组（21.16±7.396），差异有统计学意义（P＜0.05），且MVD值与淋巴结转移成正相关，即肿瘤内新生血管数量越多，淋巴结转移的几率越大。随着肿瘤内新生血管的形成，肿瘤内毛细血管渗漏形成组织液，进入淋巴管形成淋巴液，因此，肿瘤内新生血管的增加可以增加淋巴液流向淋巴结，从而促进肿瘤的转移，这就可以解释MVD值与淋巴结转移的相关性［8］。MVD值与Ki-67表达也呈正相关（P＜0.05，r=0.279）。Ki-67蛋白是一种具有蛋白酶性质的碱性蛋白质，是维持细胞周期的绝对必需物质［9］。血管生成需要蛋白质的营养支持，推测Ki-67的不断增殖可能导致新生血管数量的增加。MVD与ER、PR无相关性，表明激素受体的表达是肿瘤内部基因表达的产物，对肿瘤血管生成无明显影响［10］。朱永军［11］、崔涌［12］等大多数学者认为MVD值与肿瘤大小密切相关，本资料结果得出MVD与肿瘤大小无相关性，这种结果可能与样本量不足或样本构成不同导致。MVD与年龄无相关性，这与国内文献报道情况基本一致［1］。武变荣等［13］认为MVD值与HER-2表达有关，且呈正相关，本文得出MVD与HER-2无相关性，与上述报道不相符。研究表明，HER-2高表达时，表现为细胞增殖旺盛，侵袭力强，导致肿瘤的浸润和转移［14］，提示恶性程度高，预后差［15］。由此推测HER-2的高表达会带来肿瘤新生血管的增加，MVD值与HER-2表达应存在相关性。

研究认为，VEGF在多种肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中发挥重要作用，其高表达与肿瘤的复发和转移密切相关。本资料结果表明，在乳腺浸润性导管癌中，VEGF的高表达率达56.5%，与年龄、肿瘤大小，ER、PR、HER-2无相关性（P＞0.05），而与Ki-67表达、淋巴结转移成正相关（P＜0.05），与国外报道相一致。VEGF表达与淋巴结转移呈正相关，可能与VEGF增加蛋白水解酶活性，促进间质降解及增加血管通透性，从而促进癌细胞的浸润和转移有关［16］。同时，VEGF表达与Ki-67表达呈正相关。研究表明，Ki-67抗原是一种与细胞增殖周期相关，参与DNA合成的蛋白质，其表达可反映肿瘤的增殖活性，与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关［17］。因此，VEGF表达与Ki-67表达的相关性可能与Ki-67的不断增殖促进肿瘤血管生成有关。

微血管形成是肿瘤获取营养，肿瘤赖以存活是发生远处转移的最基本条件［18］。本资料中，MVD表达与VEGF表达有关（P＜0.01），且两者呈中度正相关（r=0.481）。表明VEGF的表达对于局部血管密度的增加具有直接作用，可能是通过自分泌或旁分泌途径促进新生血管的生成，进而促进肿瘤的侵袭生长［19］。同时，MVD=22有望成为一个新的定义MVD低高表达分界值，为今后MVD相关研究提供参考。

近年来，有关乳腺癌Ki-67表达、淋巴结转移的研究已经不断深入和成熟，但Ki-67阳性判定标准不一，淋巴结转移检测假阴性率的出现仍为乳腺癌临床治疗、预后判断带来了困扰。目前，MVD、VEGF已经被认为是促进肿瘤发生、发展及转移的两大重要因素，对乳腺癌组织中的MVD、VEGF进行免疫组化检测，这种检测方法的可靠性也已经得到大多数学者的认可。本资料表明，MVD、VEGF与Ki-67、淋巴结转移相关，且成正相关。因此，基于这种相关性，可以通过检测乳腺癌组织中MVD、VEGF的表达情况，预测乳腺癌患者的Ki-67表达情况及淋巴结转移的风险，为乳腺癌的预后判断提供参考。

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