俞建妹 刘芳 刘玉军 沈遐 卢德阳

摘要：指出了对茶花“赤丹”进行组织培养，有利于芽诱导的外植体为一级分枝，通过试验得出：较理想的芽增殖培养基为ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L，增殖系数可达6.7。

关键词：茶花“赤丹”;组织培养;芽诱导;增殖

中图分类号：S722.8 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2018）11-0060-03

1 引言

茶花“赤丹"（Camellia japonica‘Chidan）是山茶的一个品种，属常绿灌木和小乔木，原产自中国华东地区，花朵硕大、艳丽、多变、活泼。但此品种较容易产生芽变，已形成一个庞大的“赤丹”系家族，其典型的突变品种有“粉丹”、“玉丹”、“鸳鸯凤冠”、“凤还巢”、“百万富翁”和“醉杨妃”等，皆具有很高的观赏价值。本研究的茶花“赤丹”花大红色，花瓣70多枚，呈8～9轮排列，花瓣质地厚，中型花，直径10cm，完全重瓣型，为茶花珍品，常被茶花爱好者所青睐。为了能保持该种的优良遗传稳定性，规模化培育其苗木应用于花卉市场，利用高科技的组织培养技术是最有效的途径。

2 材料与方法

2.1 材料

试验材料来源于良凤江国家森林公园（南宁树木园）。以8年生，常年开花，花量大、花色艳丽的“赤丹”单株为对象，选择根兜基部萌发的半木质化或刚木质化，生长健壮的芽条作为外植体。

2.2 方法

2.2.1 外植体灭菌消毒

采集根兜萌芽条上一级、二级、三级半木质化或刚木质化的枝条为外植体。在连续放晴3d以上的气候采集枝条，首先剪去枝条的叶片，浸泡于5%洗衣粉溶液中，同时用软毛刷轻轻擦洗表面污垢，流水冲洗30min，将剪成长约5cm（至少带1个腋芽）的茎段，用75%乙醇处理30s，无菌水清洗3次后，0.1%HgCl₂溶液浸泡15min，无菌水冲洗4～6次，每次2～5min，切除茎段两端受伤组织，接种于启动培养基ER中。每级分枝接种100颗茎段，统计接种后第6～30d的外植体污染率和褐化率。

2.2.2 始芽诱导培养

张建华[1]等研究发现，ER培养基比较适合茶花树组织培养，因此，本试验始芽诱导基本培养基选择ER，6-BA、KT、ZT为芽诱导试验的细胞分裂素。将上述3种级数的无菌外植体分别接种于①ER+6-BA2.0mg/L+IAA0.5mg/L、②ER+KT1.0mg/L+IAA0.5mg/L、③ER+ZT0.5mg/L+IAAO.5mg/L的培养基内。每种培养基接种每级数外植体20瓶，每瓶接种外植体1颗，3次重复。观察记录外植体始芽萌发时间、数量及其芽形态特征。

2.2.3 芽增殖培养

本试验采用L9（34）方法，设计4个因素（基本培养基、6-BA、IAA、CH），每个因素3个水平，共9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接芽1颗，3次重复，培养50d统计新芽增殖数量，计算各处理芽增殖系数。

2.2.4 叶片黄化的遏制

在继代芽培养过程中常出现芽叶片黄化至死现象。根据芽的叶片黄化特点，开展①添加VC（抗坏血酸）10mg/L，②使用有滤网的封口膜、③调节培养基pH值等试验，每个处理接种20瓶，每瓶接芽5颗，3次重复，连续培养三周期，统计芽叶片黄化状况。每周期30d。

2.3 培养条件

试验除外，所有的培养基均附加白糖30 g/L，琼脂5g/L，pH值为6.0。培养基在1.1mp，120℃高温高压条件下灭菌消毒20min。培养室温度23℃±2℃，光照时间12～14h/d，光照强度800～3000Lx。新转接的培养物，在800Lx光照条件下培养7～10d。

2.4 数据分析方法

试验数据采用Excel 2013、SPSS18.0进行数据统计及显著性分析。

3 结果与分析

3.1 不同级数枝条灭菌的效果

连续15d采集萌芽条一级、二级、三级半木质化或刚木质化枝条进行灭菌消毒试验，枝条灭菌消毒效果统计：一级分枝不污染率70%;二级分枝不污染率61%;三级分枝不污染率55%。由此得知，一级分枝较于二级、三级分枝枝条的污染率低9%～15%。一级分枝离主杆最近，养分充足，生长健壮，体内营养运输快，新陈代谢旺盛，在相同浓度相同杀菌剂的条件下，对杀菌剂伤害的抵抗力较强，加速了伤口自我愈合速度，以降低褐化枯死率，较多地获取无菌活体，能为下一步外植体芽诱导提供较丰富的试验材料。因此，一级枝条是灭菌消毒首选的外植体。

3.2 枝条级数与细胞分裂素对始芽诱导的影响

从表1可知，参试的细胞分裂素，在同一种类同一浓度条件下，芽诱导率大小排序为一级枝条>二级枝条>三级枝条。一级枝条始芽萌发需要的时间也最短，添加ZT的培养基，仅培养21d始芽萌发了，所以选择一级枝条作外植体，有利于始芽的诱导，加快芽培养速度。此原因可能在于一级枝条直接萌发于主干。发育早期的组织细胞转化能力较强，而发育晚期的组织细胞转化能力较差，甚至无转化能力[2]。在细胞分裂素对腋芽诱导及生长的影响中可知，KT、ZT与6-BA对一级侧枝诱导芽作用存在显著性差异。KT与ZT较6-BA更容易促进始芽萌发，但芽不健康。因此，适宜芽萌发的激素种类和浓度不一定适宜芽的生长。为了培育生长健壮的芽，利于下一步芽增殖培养，综合始芽诱导率和芽形态特征表现，筛选出6-BA是比较适宜山茶“赤丹”外植体始芽诱导的细胞分裂素和浓度。

3.3 不同培养基配方对芽增殖效果的影响

从表2可知，6-BA对芽的增殖起主导作用。芽的增殖系数随着6-BA浓度的递增，总体呈向上趋势，处理9除外，处理3和处理6芽增殖系数为高，分别是8.0和7.0。其次是处理2、处理5和处理8，芽增殖系数在5以上。但处理3和处理6的丛芽均出现不同程度的玻璃现象，而处理2和处理5的丛芽生长正常。原因可能是培养基中6-BA浓度為5.0mg/L，对山茶“赤丹”的茎尖和分生组织的细胞分化和生长刺激作用过大，加上在培养基中添加了营养丰富的CH，使培养物直接增殖不定芽形成试管苗的进程快、时间短，部分分生组织还没能来得及适应新的环境[3]，而导致细胞分化受损，细胞质稀薄、细胞壁发育不良之故。CH对不定芽的分化和生长具有较强的促进作用，在含较高6-BA的培养基中添加CH浓度不宜过高。处理2和处理5中BA2.5mg/L，分别添加CH250mg/L和100mg/L，芽增殖系数虽然比处理3和处理6的分别低19.400，4.4%，但分化出的丛芽生长健康。本试验采用的3种基本培养基，在适宜的6-BA和CH浓度条件下均能使增殖芽健康生长。为了能培育出较多的健壮芽用于进一步芽扩繁及生根，综合考虑芽的增殖系数及生长情况，挑选出相对较优的增殖配方为处理2。

3.4 不同方法对组培芽叶片黄化遏制效果的影响

一般情况下，茶花“赤丹”继代芽培养到第6代时叶片出现黄化至枯死现象，为了改善或遏制此现象，根据茶花自然生态习性，将继代了5代的“赤丹”增殖芽分别转接到：①添加Vc10mg/L，②使用有滤网的封口膜封口，③调节培养基pH值到5.5这3种不同处理方法的培养基内培养，连续培养3代，结果表明：第3种方法对培养物叶片黄化或褐化现象未得到良好的改善。添加Vc10mg/L的培养基中叶片黄化现象得到了有效的控制，新长出的叶片第二代培养时已没有出现局部黄化或褐化现象，第三代培养时，芽得到正常生长。Vc是一种广泛分布在植物中的维生素，在植物体内参与电子传递系统中氧化还原作用，促进植物新陈代谢[4]，提高植物抵抗干旱、臭氧和紫外线作用。完整植株是能够制造维生素的，但是离体却不能合成足够的维生素[5]。可能是随着“赤丹”继代芽生长速度的加快，Vc的合成不能满足生长的需求，新陈代谢减弱而导致芽的叶片黄化。使用有滤网的封口膜能增加瓶内氧气输人，促进芽的新陈代谢，叶片黄化程度有所改善，但其效果次于添加Vc的。所以，为了培养健康的增殖芽，宜在培养基内添加Vc10mg/L或培养容器使用有封口膜的瓶盖，能比较有效地遏制继代芽叶片黄化现象。

4 结论与讨论

根兜萌芽一级分枝灭菌消毒效果较好，且开始萌芽时间短。其是最佳始芽诱导的细胞分裂素，浓度为6一BA2.0mg/L，萌芽率高且始芽健壮，能有效地接种入芽增殖培养基为ER（+Vc10mg/L）+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+CH250mg/L中，丛生芽生长快速，有侧芽萌发，增殖系数可达6.7，且能遏制或改善增殖芽叶片黄化枯死现象，能满足生产化育苗需要，进行产业化生产。

适宜始芽诱导6-BA浓度低于芽增殖培养的浓度，原因可能是外植体来源于一级分枝幼嫩组织，养分充足，细胞活跃，分裂能力强，本身含有较高的生长激素水平，所以不需添加太多的外源激素，不定芽便能快速萌发。在瓶苗培养过程中出现黄化现象是否是培养物合成VC量不能满足自己生长需求，引起自身氧化还原效率低，新陈代谢缓慢而引起叶片黄化，或是否芽生长代谢过程中排出的二氧化碳过多，培养瓶内氧气不足，造成二氧化碳中毒，引起叶片黄化，有待进一步的研究。

参考文献：

[1]张建华，毛平生，彭火辉.茶树的组培快繁技术初探[J].蚕桑茶叶通讯，2003（4）：32～33.

[2]许鸿川.植物学（南方本）[M].北京：中國林业出版社，2010：166.

[3]李胜，李唯.植物组织培养原理与技术[M].北京：化学工业出版社，2007：36～37，10.

[4]张洪昌，李星林.植物生长调节剂使用手册[M].北京：中国农业出版社，2011：118～119.