，

高密度脂蛋白胆固醇(high- density lipoprotein，HDL- C)因其可逆转胆固醇、保护内皮细胞、抗氧化、抗炎、抗凝、促进受损的内皮细胞愈合等作用而具有潜在的抗冠状动脉粥样硬化作用[1- 2]。但是，多中心临床试验研究结果显示提高HDL- C水平并没有起到所预期的抗冠状动脉粥样硬化作用[3- 4]。HDL- C水平并不能作为预防冠状动脉粥样硬化的唯一参考指标。冠状动脉痉挛与内皮功能障碍密切相关，而且冠状动脉痉挛与冠状动脉狭窄和急性心肌梗死所致的严重心血管事件呈正相关[5- 6]。本研究以急性心肌梗死(acute myocardiai infarction，AMI)和稳定型心绞痛(stable angina，SA)病人为研究对象，对比两者体内HDL- C对内皮功能影响的差异，以进一步明确HDL- C功能在抗动脉粥样硬化中的重要性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 AMI组和SA组病人各25例，为2015年6月—2015年12月就诊于延安大学附属医院心内科病人。AMI组年龄30岁～52岁(38.52岁±8.46岁)；SA组年龄32岁～55岁(40.64岁±9.26岁)。排除糖尿病、高血压、严重感染性疾病、肾衰等疾病。对照组(C组)为来延安大学附属医院体检的28名健康志愿者，年龄35岁～ 50岁( 41.42岁±7.57岁。所有研究对象均签署知情同意书，本研究已通过延安大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 血浆HDL- C提取 按文献描述[7]，采用梯度离心法提取HDL- C：入院时即刻抽取病人空腹静脉血离心离心(4℃，4 000 r/min，10 min)后将加入1∶500 的EDTA(Sigma- Aldrich，134 mmol/L)和1∶10 000 的BHT(Sigma- Aldrich，200 mmol/L)的血浆移入预冷的超高速管(38 mL，Beckman coulter公司)混匀后依次进行3次离心(4℃，50 000 r/min，21 h)。第一次离心后血浆由上至下分为：乳糜颗粒(CM，乳白色)、水、低密度脂蛋白(LDL，浅橘黄色)、高密度脂蛋白(亮绿色)、杂质(深橘黄色)。第二次离心后血浆由上至下分为：LDL(浅橘黄色)、1.063密度液、HDL(亮绿色)、杂质(深橘黄色)。第三次离心后血浆由上至下分为：HDL(亮绿色)、1.21密度液、杂质(深橘黄色)。每次离心后均将HDL抽取用0.22 μm的滤器(MerkMillipore公司)过滤，过滤后的HDL用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Thermo Scientific 公司)测定HDL蛋白浓度后放4℃冰箱备用(提好的HDL需3周内用完)。

1.3 HDL对内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的检测 取4代脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs，Scien Cell公司)种植于6孔板，待内细胞密度>95%后孵育HDL- C。试验分空白组(blank组，不处理)、C组(加对照组HDL- C，100 μg/mL)、SA组(加SA组HDL- C，100 μg/mL)、AMI组(加AMI组HDL- C，100 μg/mL)。孵育12 h后用RIPA细胞裂解提取细胞蛋白，超声破碎仪(20 Hz 20 s)充分破碎后离心(4℃，12 000 r/min离心 10 min)，取上清用BCA蛋白浓度测定，蛋白浓度后，行Western检测内皮细胞eNOS及其磷酸化位点S1177表达变化。

1.4 HDL- C对内皮细胞一氧化氮(NO)水平的检测 取4代HUVEC种植于24孔板内，待内细胞密度>95%后进行HDL- C孵育。分空白组(blank组，不处理)、阳性对照组(Vascular endothelial growth factor，VEGF，50 ng/mL，R&D公司)、C组(加对照组HDL- C，100 μg/mL)、SA组(加SA组HDL- C，100 μg/mL)、AMI组(加AMI组HDL，100 μg/mL)。孵育30 min后弃取去细胞上清，并用含钙镁的HBSS清洗细胞3次，吸净残余的HBSS后向细胞内加入500 μL含钙镁的HBSS(含L- arginine 25 mM)再次刺激细胞30 min后吸取细胞上清用来测定NO，按南京建成一氧化氮试剂盒说明书步骤检测各组NO含量，记录数据以供后续分析。各组细胞用RIPA裂解液提取蛋白，并用BCA法测量蛋白浓度用来换算最终每克细胞蛋白的NO产量。

1.5 HDL- C对内皮细胞氧自由基(O2·-)水平的检测 取4代HUVEC种植于48孔板内，待细胞密度>95%后一半细胞首先加eNOS通路抑制剂N- 硝基- L- 精氨酸甲酯(L- NAME，1 mmol，SIGMA公司)预先孵育细胞30 min后在行HDL- C孵育。实验分组：空白组(blank组，不处理)、阳性对照组(Hydrogen peroxide solution，H2O2，0.26 mM，SIGMA公司)、C组(加对照组HDL- C，100 μg/mL)、SA组(加SA组HDL- C，100 μg/mL)、AMI组(加AMI组HDL- C，100 μg/mL)。孵育30 min后向细胞内加入含有光泽精(lucigenin，5 μM，SIGMA公司)的Kreb’s液再次孵育细胞5 min后用酶标仪(SpectraMax M5/M5e multi- detection reader，Molecular Devices)检测相对发光强度(relative luminescence units，RLU)反应氧自由基含量。测完后将各孔细胞用RIPA裂解液提取蛋白并用BCA法测量蛋白浓度以换算最终O2·-量(RLU / sec / mg 蛋白)，记录数据以供后续分析。

2 结 果

2.1 各组临床资料比较 对照组、SA组及AMI组在年龄、性别、体重指数上无统计学意义，但SA组及AMI组的血浆脂蛋白水平普遍较对照组偏高。详见表1。

表1 各组临床资料比较

2.2 HDL- C对内皮细胞eNOS表达的影响 与空白组比较，C组HDL- C促进内皮细胞eNOS(见图1A)及其磷酸化位点S1177的表达有统计学意义(P<0.05，见图1B)；与C组HDL- C比较，SA组HDL促进eNOS及其磷酸化位点S1177表达的能力有所降低，但两组无统计学意义(P>0.05，见图1)；与空白组比较，AMI组HDL- C抑制了eNOS(P<0.05，见图1A)及其磷酸化位点S1177的表达(P<0.05，见图1B)。与空白组比较，C组和SA组的HDL- C均促进内皮细胞eNOS的表达，AMI组HDL- C抑制了内皮细胞eNOS的表达。与空白组比较，C组和SA组的HDL- C均促进内皮细胞eNOS的磷酸化位点S1177的表达，AMI组HDL抑制了内皮细胞eNOS的磷酸化位点S1177的表达。

与Blank组比较，* P<0.05。

2.3 HDL对内皮细胞NO水平的影响 图2A可见，与空白组比较，VEGF明显促进内皮细胞NO的含量升高(P<0.05)，提示本次试验有效可信；C组和SA组HDL也较空白组促进内皮细胞NO的产生(P<0.05)，虽然SA组较C组促进NO产生的能力有所减弱，但二者无统计学意义(P>0.05)。AMI组非但没有促进NO的产生，反而抑制了NO的生成(P<0.05)。

2.4 HDL- C对内皮细胞O2·-水平的影响 与空白组比较，H2O2明显促进内皮细胞O2·-的产生(P<0.05)，提示本次试验有效可信；C组HDL- C一定程度上抑制了内皮细胞O2·-的生成(P<0.05)；SA组对内皮细胞O2·-的含量无明显影响(P>0.05)；AMI组HDL明显刺激了O2·-的产生(P<0.05)。由AMI组刺激生成的O2·-可以很大程度上被eNOS通路抑制剂L- NAME所阻断(P<0.05)，提示AMI组HDL主要是通过eNOS信号通路来影响O2·-的含量的(见图2B)。 C组、SA组HDL- C均促进内皮细胞NO的产生，AMI组HDL- C抑制内皮细胞NO的生成。 C组HDL- C抑制内皮细胞O2·-的产生，AMI组HDL刺激内皮细胞O2·-的产生，SA组HDL对内皮细胞的O2·-含量无影响。AMI组HDL刺激生成的O2·-可以很大程度上被L- NAME阻断。

图2 各组HDL- C对内皮细胞NO及O2·-含量的影响

3 讨 论

本研究通过梯度离心提取健康志愿者(对照组)、AMI病人(AMI组)和SA病人(SA组)的HDL- C，对比三组HDL- C对内皮功能的影响发现：与对照组比较，SA组HDL- C对内皮细胞eNOS、NO及O2·-的影响无统计学意义(P>0.05)；与SA组比较，AMI组HDL- C明显抑制内皮细胞eNOS及其磷酸化位点S1177的表达，降低NO水平和增加O2·-含量(P<0.05)。提示AMI时病人体内HDL- C失去正常的心血管保护功效，而且还表现出了损害心血管功能的作用，HDL- C的这一改变可能与AMI病人体内的特殊内环境有关。

越来越多的研究发现，HDL- C具有逆向转运胆固醇、清除或减少氧化脂质、抗炎、抗凝、保护内皮细胞、修复血管内皮、促进血管新生等功效[1- 2]。血浆低水平的HDL- C与心血管事件的高发密切相关[1]，而且对于接受他汀治疗的冠心病病人，低水平的HDL- C病人在治疗过程中发生心血管事件概率也较高[8- 9]。Mineo 等[10- 11]发现，正常的HDL- C通过Src- AKT- MAPK途径刺激内皮细胞中eNOS及其磷酸化位点Ser1177的表达，进而促进内皮细胞NO的产生。还有研究显示[12- 13]：HDL- C发挥其促进内皮细胞迁移、血管内膜修复及抗凋亡作用是通过内皮祖细胞- PI3- P44/42- eNOS途径起效的。本研究对照组在试验结果中的作用也再次证实，正常HDL- C可以促进内皮细胞eNOS及其磷酸化位点的表达，刺激NO的产生和抑制O2·-的生成。

AMI的病理生理包含了早期的炎症反应以及后续的动脉粥样硬化斑块破裂和血小板黏附/聚集、血栓形成和血管痉挛。这一病理过程必然导致严重心肌缺血而危及病人生命，如果有一种有些缓解或改善血管痉挛导致的心肌缺血必然可以有降低AMI的致死率。HDL- C因其保护内皮细胞、修复血管内皮、促进血管新生等功效而被广大研究者所关注[2]，然而关于可以提升血浆HDL- C的胆甾醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)抑制剂torcetrapib(托彻普)和 dalcetrapib(达塞曲匹)的多中心临床随机对照研究并没有有效减少相关心血管事件的发生，反而出现了一些并发症[3- 4]。由此可见，对HDL- C功能、代谢及功能成分的进一步研究是必须的，这对开发新的以HDL- C为靶向的冠心病治疗方案有莫大的帮助。有研究显示[14]，HDL- C在某些情况下可能失去其原有的保护心血管作用，甚至会表现出相反的功能：冠心病、糖尿病及慢性肾功能不全时HDL- C失去抗炎功能，而且还表现出趋炎作用。Zheng 等[15]研究发现，冠心病病人体内HDL- C的主要功能蛋白载脂蛋白A- I (apolipoprotein A- I)，会被其体内的某些炎性因子如髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)修饰而失去原有抗炎功效。Sunita 等[16]研究提示，对于HDL- C功能异常且无明确冠心病人群有更高危的心血管事件发生率，也更需要服用降脂药物来降低相关可能出现的风险。因此，HDL- C水平和功能的测量在冠心病风险评估中起着重要作用。本研究通过对比对照组、SA组和AMI组HDL- C发现，AMI组HDL- C抑制了内皮细胞eNOS及其磷酸化位点S1177的表达，同时还抑制了内皮细胞NO的产生和刺激了O2·-的生成。这一结果提示AMI时(AMI组)机体处于应急状态，而且冠脉血栓的破裂和各种炎性因子的刺激可能是导致HDL- C功能异常的罪魁祸首；而对于SA组，机体内环境处于相对稳定状态，因而与对照组比较，SA组HDL- C虽然也一定程度上抑制了内皮细胞eNOS及其磷酸化位点S1177的表达，同时还抑制了内皮细胞NO的产生和刺激了O2·-的生成，但是二者差异无统计学意义。

本研究显示AMI病人体内的HDL- C抑制内皮细胞eNOS活化及NO的生成，同时刺激了O2·-的产生，这些生理改变必将导致内皮功能损害和病情变化。因此改善HDL- C功能较提高HDL- C数量有更大的临床意义。

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