石 晶 谭小波 杨 洁 郝佳颖 李 伟 李 娜 何 彦

(承德医学院附属医院眼科，河北 承德 067000)

弱视是指眼底没有发生显著的器质性病变，主要由于屈光参差、形觉剥夺或双眼高度屈光不正、单眼斜视等因素导致单或双眼视力下降〔1〕。弱视对患者视力会产生影响。虽然弱视能完全医治，但如果错过了最佳治疗时期会影响最佳的治疗效果，降低生活质量。因此，对弱视的有效治疗已经成为研究热点〔2～6〕。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 白芍(RPA，西安天瑞有限公司)；N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)1引物 (生工生物科技有限公司)；25%戊二醛(郑州雅盛电子科技有限公司分装)，Trizol试剂(GIBCO-BRL公司)，RNA LA PCRTMkit(AMV)试剂盒(TaKaRa公司)，SYBR®Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa公司)。实时定量聚合酶链反应数据分析软件StepOne plus，ABI PCR仪(Thermo赛默飞世尔科技公司，美国)，电子天平(上海精天电子仪器有公司)。微电极拉制器，视觉电生理系统(罗兰，德国)。

1.2动物 初生家养幼猫18只，体重约350 g，雌雄不分，在天津医科大学实验动物中心饲养1 w，常规检查双眼，确认外眼、屈光间质及眼底无异常。随机分为正常组、模型组及RPA组，各6只。其中模型组和RPA组水合氯醛麻醉后造模：用碘伏常规消毒左眼，冲洗结膜囊(庆大霉素)，沿角膜缘剪开颞侧球结膜，随后进行分离结膜下筋膜，在赤道部用斜视钩勾出外直肌，然后剪断外直肌，分离周围筋膜，将球结膜整理好，庆大霉素再次冲洗结膜囊，待苏醒后送回动物房。3组均饲养在动物房中，自由饮水。给药方法：RPA组每日分别按100 mg/kg灌胃RPA。模型组和正常组均灌服等体积生理盐水，连续30 d。

1.3视觉诱发电位 麻醉幼猫后在其人字缝顶点上方的正中线开一小洞至皮质，插入针电极作为作用电极，其中Ag-AgCl置于前额做参考电极，另一盘状电极置于右耳作为地电极。然后固定好猫，确认其视网膜中央区的反向延长线投射在刺激器中央位置，并用相应的镜片矫正屈光。采用棋盘格反转刺激，距离50 cm，刺激模式是0.3 cpd，每个空间频率扫描10次。图形视觉诱发电位(PVEP)及扫描视觉诱发电位(SVEP)测量均在暗室中进行。

1.417区的细胞外记录 麻醉幼猫后采用苯肾上腺素收缩瞬膜，检影双眼，随后配戴合适的接触镜。将猫头固定在立体定位仪上，暴露猫颅骨，在右侧半球P-5，L-3处直径切开颅骨并去除硬脑膜。采用视觉刺激系统，刺激条件：调整微电极拉制器的磁力为2.5，热力为4.0。微电极记录：①仅对右眼刺激有反应；②两眼放电频率有差异；③双眼分别刺激时放电频率基本一致；④两眼放电频率存在差异；⑤仅对左眼刺激有反应。

1.5实时定量聚合酶链反应 将眼组织加入Trizol中匀浆，每1 ml Trizol 加入0.2 ml 三氯甲烷；剧烈混合30 s后，4℃ 12 000 r/min离心10 min，将水相层液体小心转移至新离心管中；加入0.5 ml异丙醇，混合均匀，室温静置10 min；随后4℃ 12 000 r/min离心10 min，可见少量RNA沉淀；弃上清液，75%乙醇洗涤沉淀2次；4℃ 7 500 r/min离心沉淀5 min，弃上清，空气中干燥RNA沉淀，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解RNA沉淀。取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法测定RNA纯度及浓度；计算总RNA浓度。将溶解后的RNA按试剂盒说明书进行逆转录及扩增。引物见表1，扩增条件为95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 32 s，共40个循环。

1.6统计学处理 采用SPSS10.0软件行单因素方差分析(ANOVA)。

表1 引物序列

2 结 果

2.1各组左眼SVEP视力比较 与正常组〔(1.35±0.19)cpd〕相比，模型组左眼SVEP视力〔(0.73±0.24)cpd〕明显下降(P<0.01)，RPA组〔(1.34±0.08)cpd〕与模型组比较，左眼SVEP视力明显上升(P<0.01)。

2.2各组左眼PVEP视力比较 与正常组相比，模型组及RPA组左眼N75及振幅值差异无统计学意义(P>0.05)。与正常组相比，模型组P100值及N75-135显著上升(P<0.05)；与模型组相比，RPA组P100值及N75-135显著下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组左眼PVEP视力比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

2.3RPA对斜视弱视猫17区眼驱动细胞的影响 模型组左侧17区眼驱动细胞水平(3.74±0.68)较正常组(4.95±0.71)明显下降(P<0.01)，RPA组显著上升(12.02±1.02，P<0.01)。模型组右侧17区眼驱动细胞水平(21.33±1.19)较正常组(5.01±0.72)明显上升(P<0.01)，RPA组(11.15±1.07)较模型组显著下降(P<0.01)。

2.4各组左侧17区、左侧21a区NMDAR1 RNA表达水平比较 模型组左侧17区、21a区NMDAR1 RNA表达水平(0.46±0.15，0.53±0.13)较正常组(1.75±0.22，0.81±0.21)明显下降(P<0.01)，RPA组NMDAR1 RNA表达水平(0.72±0.20，0.75±0.11)显著高于模型组(P<0.01)。

2.5各组右区17区、右侧21a区NMDAR1 RNA表达水平比较 模型组右侧17区、21a区NMDAR1 RNA表达水平(0.62±0.16，0.43±0.15)较正常组(18.2±0.22，1.48±0.40)明显下降(P<0.01)，RPA干预组NMDAR1 RNA表达水平(1.05±0.21，0.68±0.25)明显高于模型组(P<0.01)。

3 讨 论

弱视是视觉的异常发育，其治疗的关键在于发现及时、早期治疗。遮盖治疗是治疗弱视最有效的方法，无论在什么年龄段都适用，但是此治疗方法也存有弊端，即治疗时间太长及依从性欠佳〔7～9〕。中枢神经系统的视皮层是弱视主要的病变位置，最初发生在初级视皮层水平，随后扩大到更高的视觉水平〔10〕。阿托品、缩瞳剂、左旋多巴等药物治疗也在临床中应用，但是一般作为二线治疗方案〔11～16〕。因此，临床迫切需要寻找一种新的有效的药物治疗弱视。本实验研究表明，RPA能显著提升幼猫SVEP视力、PVEP视力，提高17区的眼驱动细胞数，使NMDAR1表达上升。重建患者受损视皮层发育的可塑性，同时恢复神经元的形态以及功能是弱视治疗的基本，进而修复神经传导通路，使皮层内神经元的兴奋性同步，最终使分别接受双眼的视皮层区域达到均衡状态。

1朱 娟，燕振国，张文文.屈光不正性弱视儿童皮层功能与弱视程度关系的功能磁共振研究〔J〕.中国斜视与小儿眼科杂志，2011；19(1)：1-5.

2郭承伟.肾与目的关系探讨〔J〕.中华中医药杂志，2005；20(1)：23-5.

3郑 煜，黎晓新，牛兰俊，等.左旋多巴对形觉剥夺性弱视猫视皮层17区神经生长因子的影响〔J〕.眼科研究，2009；27(11)：988-91.

4孙晓楠，陶 军，郝旭红，等.视觉发育敏感期单眼形觉剥夺大鼠视觉电生理及视皮质超微结构研究〔J〕.国际眼科杂志，2012；12(11)：2075-7.

5缪超英，陈日新，裴重刚.热敏灸治疗大龄儿童弱视的疗效观察〔J〕.中华中医药杂志，2011；26(3)：461-3.

6LeVay S，Ferster P.Relay cell classes in the lateral geniculate nucleus of the cat and the effect of visual deprivation〔J〕.J Comp Neurol，1977；172(4)：563-84.

7Headon MP，Powell TP.Cellular changes in the latera l geniculate nucleus of infant monkeys after suture of the eyelids〔J〕.J Anat，1973；116(1)：135-45.

8LeVay S，Wiesel TN，Hubel DH.The development of oculardom nance columns in normal and visually deprived monkeys〔J〕.J Comp Neurol，1980；191：1-51.

9Guillery RW.Binocular competition in the control of geniculate cell growth〔J〕.J Comp Neurol，1972；144：117-29.

10Headon MP，Sloper JJ，Hios RW，etal.Effects of monocular closure at different ages on deprived and undeprived cells in the primate latera l geniculate nucleus〔J〕.Brain Res，1985；350(5)：57-78.

11Nucci C，Piccirilli S，Nistico R，etal.Apoptosis in the mechanisms of neuronal plasticity in the developing visual system〔J〕.Eur J Ophthalmol，2003；13(Suppl 3)：S36-43.

12Kaczmarek L，Chaudhuri A.Sensory regulation of immediate-early gene expression in mammalian visual cortex：implications for functional mapping and neural plasticity〔J〕.Brain Res Brain Res Rev，1997；23(11)：237-56.

13Soares JG，Pereira AC，Botelho EP，etal.Differential expression of Z if268 and c-fos in the primary visual cortex and lateral geniculate nucleus of normal Cebus monkeys and after monocular lesions〔J〕.J Comp Neurol，2005；482(2)：166-75.

14Mower GD.Differences in the induction of Fos protein in cat visual cortex during and after the critical period〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，1994；21(5)：47-54.

15Rosen KM，McCormack MA，Villa-Komaroff L，etal.Brief visual experience induces immediate early gene expression in the cat visual cortex〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1992；89：5437-41.

16Fosse VM，Heggelund P，Fonnum F.Postnatal development of glutamatergic，GABAergic，and cho linergic neurotransmitter phenotypes in the visual cortex，lateral geniculate nucleus，pulvinar，and superior co lliculus in cats〔J〕.J Neurosci，1989；9(5)：426-35.