刘东育等

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2017.26.66

摘要 目的：探讨荧光PCR技术在使用亚胺培南治疗的患者中检测真菌感染的临床意义。方法：选择31例使用亚胺培南治疗的患者，收集治疗前后的标本各2份。1份采用传统培养法，1份采用PCR法检测真菌。结果：两种方法均检测出白色念珠菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌。PCR法检出阳性11例，阳性率35.48%；传统培养法检测阳性5例，阳性率16.12%。5 dPCR检测阳性率5.2%，7 d检出阳性率35.48%。结论：PCR检测真菌感染的稳定性好，敏感性和特异性均较理想。

关键词 抗菌药；亚胺培南；真菌病；荧光PCR技术

随着广谱抗菌药的广泛应用，临床条件性致病菌和耐药菌株越来越多，特别是真菌感染日益增多，而其临床表现缺乏特异性，易误诊、漏诊，延误最佳治疗时机，或行真菌预防性治疗导致过度医疗。本研究对使用亚胺培南一西司他丁钠治疗的患者应用荧光定量PCR技术检测其血液、深部痰液中念珠菌DNA，可敏感、快速及时和准确地报告结果，为诊断患者真菌感染、使用抗真菌的时机及抗真菌药的选择提供临床依据。

资料与方法

标本来源于2013年1月-2017年1月我院重症医学科收治需使用亚胺培南治疗的患者31例，其中重症胰腺炎7例，重症肺炎8例，胃肠穿孔术后15例，其他1例。

传统培养及科玛嘉显色鉴定：将临床样本接种于萨布罗培养基中进行培养，涂片镜检为真菌后接种至科玛嘉假丝酵母菌显色培养基（CHROMA-gar）中进行培养，假丝酵母菌属类别根据菌落颜色的变化进行鉴定。白色假丝酵母菌为翠绿色，热带假丝酵母菌为蓝灰色，克柔假丝酵母菌为粉红色，光滑假丝酵母菌为紫色，其他假丝酵母菌为白色（如近平滑假丝酵母菌等）。萨布罗培养基购自天津市金章科技发展有限公司，科玛嘉显色培养基购自郑州博赛生物技术股份有限公司。

真菌基因提取及PCR扩增：待检标本的真菌DNA用Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提取，其中血液样本先进行红细胞裂解处理。根据假丝酵母菌IST1、ITS2及拓扑异构酶Ⅱ的序列设计的不同种类的特异性引物，引物均由生工生物工程（上海）有限公司代为合成。以提取的基因组DNA为模板，采用以下试验体系和程序进行PCR扩增。PCR反应体系（终浓度）：1×PCR缓冲液（含MgCl₂），0.2μmol/L上、下游引物，0.2 mmol/L dNTP，DNA模板，2.5 UTaqDNA聚合酶，灭菌ddH₂O补齐至50μL。每次PCR试验均需设置空白对照（模板DNA用ddH₂O代替）及阳性对照，整个过程需严格控制污染。

方法：31例患者均使用亚胺培南1.0g/次，1次/8 h，静脉滴注治疗，其余为一般对症支持治疗。收集患者亚胺培南治疗前后的血液或痰液备各2份，送检：1份传统培养法，1份PCR法检测真菌。于治疗前、治疗5 d时、治疗7 d时分别送检。其中排除治疗前PCR法查真菌阳性者。

统计学方法：所有数据采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，采用X²检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

结果

临床标本的检测结果：在31例的临床标本中，两种方法均检测出白色念珠菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌，以白色念珠菌为多。PCR法检出阳性11例，阳性率35.48%；真菌传统培养法检测阳性5例，阳性率16.12%。

PCR与传统真菌培养法比较：两种方法对念珠菌所检出率差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

不同时间真菌检测阳性率：在31例的标本中，5 d PCR检测阳性率5.2%，7d检出阳性率35.48%，以白色念珠菌为多见，见表2。

讨论

抗菌药物的使用是条件致病菌真菌继发感染的主要原因，多见于肺部感染，主要为深部白色念珠菌感染。其中念珠菌多部位定植是重症患者发生侵袭性真菌感染的独立危险因素。治疗期间在3～5 d即有真菌生长，以5～20 d发生率最高。而传统的真菌培养法需用5～7 d出结果，且敏感性不高，而PCR法2 h即可完成。传统的真菌培养法与PCR法阳性检出率有显著差异，充分表明了PCR法比传统培养法灵敏。需要注意的是PCR法检测中发生污染的可能性大，导致假阳性，对检测结果需要综合分析。

亚胺培南一西司他丁钠为广谱抗菌药，在ICU重症感染患者中的使用较广泛。本品适用于多种病原体所致和需氧（厌氧）菌引起的混合感染及病原菌未确定前的早期治療。本研究以亚胺培南治疗后5 d PCR法检查真菌阳性率5.2%，7 dPCR真菌阳性率35.48%。根据PCR法检查结果及时给予抗真菌治疗，取得了较好的临床效果。本实验的目的是通过荧光定量PCR技术对患者疑似真菌感染进行敏感、快速、及时和准确的检查，对患者合理使用抗真菌药的时机及抗真菌药物的选择寻找依据。随着荧光PCR标记技术的飞速发展，其特性已应用于念珠菌临床快速的诊断、基因分型、耐药等研究。endprint