杨 骁，李梦侠（第三军医大学大坪医院肿瘤中心，重庆400072）

肿瘤因发病率逐年提高，已成为危害人类健康的主要因素，而晚期肿瘤治疗疗效有限，是目前肿瘤研究领域的重要课题。尽管随着基因检测技术的普及和靶向药物的问世，精准医学给肿瘤的治疗带来了曙光，但分子靶向治疗仅适用于部分经过选择的肿瘤患者。因此，目前大多数晚期恶性肿瘤的治疗仍然是基于传统放化疗的综合治疗模式。然而，最初对于放化疗有效的肿瘤细胞最终会因治疗抵抗而导致肿瘤进展，这是肿瘤治疗的瓶颈和难点。DNA损伤是放化疗致伤肿瘤细胞的主要机制，而肿瘤细胞中有完善的DNA修复机制，可以快速修复放化疗所致的DNA损伤，产生放化疗抵抗。因此，DNA修复基因作为抗肿瘤的新靶点是目前研究的热点。2017年7月，课题组与意大利的TELL及PIAZZA课题组在自然通讯上联合发表的“Mammalian APE1 controls miRNA processing and its interactome is linked to cancer RNA metabolism”一文，对脱嘧啶核酸内切酶（APE1）参与miRNA剪切成熟过程调控基因表达的相关机制做了详细的阐述[1]。

1 研究背景

肿瘤发生发展、耐药与miRNA的关系，以及DNA修复与miRNA代谢的关系。APE1是多种抗肿瘤治疗抵抗的重要基因，但是其关键的作用机制仍不明确。APE1具有AP核酸内切酶活性，为负责修复DNA碱基简单氧化和烷化性损伤的DNA碱基切除修复（BER）途径主要限速酶之一，同时，APE1还可影响多种肿瘤细胞耐药关键基因的表达。越来越多的研究表明，APE1是连接DNA BER、转录因子的氧化还原调控和氧化应激等重要生物学效应的桥梁，对于细胞的存活至关重要[2-3]。课题组前期大量研究发现，APE1在多种恶性肿瘤中表达水平明显升高，高表达率为72%～90%，且与晚期非小细胞肺癌（NSCLC）化疗后预后不良呈显著正相关[2]。更为重要的是，肿瘤高表达的APE1与多种肿瘤耐药相关，包括能产生DNA碱基损伤烷化剂和X射线形成的电离辐射，以及产生DNA链间交联的铂类、阻碍微管形成的紫杉类、形成DNA双链断裂的博来霉素和依托泊苷[4]，甚至包括作用于表皮生长因子受体（EGFR）突变体的吉非替尼等分子靶向药物。前期研究发现，血清中的APE1可以反映部分肿瘤组织APE1的水平，并且可以作为预测NSCLC对含铂双药化疗反应（客观缓解率和无进展生存时间）和总生存的生物标记物[5]。这些证据强烈提示，APE1在肿瘤细胞中的高表达可以显著增加肿瘤对多种抗肿瘤治疗的抵抗，但有趣的是，APE1经典的DNA损伤修复无法完全解释其中大多数药物抵抗的机制（如EGFR-TKIs），推测APE1可能通过未知的分子机制参与了对抗肿瘤治疗抵抗更为重要和普遍的调控机制——细胞凋亡抵抗。凋亡抵抗不仅是肿瘤发生中的重要特征，还是介导肿瘤治疗抵抗最为重要和普遍的机制。目前，关于肿瘤细胞凋亡抵抗的机制尚不完全清楚。近年来研究发现，除了众多凋亡相关基因外，miRNA在其中的重要作用也越来越受到重视。实际上，在细胞凋亡途径中，凋亡基因与相关miRNA相互交织构成了一个十分复杂的调控网络，理论上这些凋亡相关蛋白与miRNA除了网络式相互调控作用外，还可能存在节点的直接作用，但国内外却鲜有报道。

直到最近，TELL课题组及其他一些课题组证实，APE1具有重要的RNA酶活性，但是目前并不清楚这一活性在什么生物学过程中发挥作用。APE1是一个经典的DNA结合蛋白，其蛋白结构可以插入DNA双螺旋的大沟并与AP位点结合。加拿大LEE课题组偶然发现，将APE1引入RNA世界，APE1能够结合在cmyc的mRNA编码区决定序列，并且优先选择在UA和CA区域之间剪切主链造成c-myc的mRNA的降解，首次揭示了APE1对RNA的降解作用[6]。该课题组进而发现，APE1可以剪切多种RNA，包括CD44的mRNA、miR-21、miR-10b和SARS病毒的RNA组分，这项研究提示APE1对RNA的作用具有序列非选择性，但是在嘌呤碱基之后具有更强的切除作用[7]。随后的研究在蛋白结构和生化实验中均证实了APE1对RNA具有非选择性剪切作用，不依赖于AP位点，但是参与RNA剪切的蛋白活性区域与AP内切酶相同，很可能是其参与RNA代谢的重要机制[8]。有研究发现其具体机构包括：（1）APE1可以通过其N端结构域的33个氨基酸残基直接在体外结合具有特定结构的RNA，包括一些primiRNA[9]；（2）APE1可以通过其内切酶活性切开单链RNA上的缺碱基位点，参与RNA的降解[10]；（3）APE1具有3'-RNA磷酸酶和3'-核苷酸外切酶活性[8]；（4）APE1可以调控c-myc的mRNA水平及其在肿瘤细胞中的半衰期[6]。有趣的是，除了经典的3'→5'-核苷酸外切酶，似乎没有其他的酶可以识别并去除RNA分子中的缺碱基和氧化位点，也无法去除RNA分子中3'-末端的磷酸基团，这也使得研究肿瘤细胞RNA代谢过程中APE1发挥的非典型活性变得十分重要[11]。同时，尽管这些研究都从生化角度证实了APE1是一个新型的RNA酶，并且对多种RNA底物有作用，但是目前仍然不明确APE1的RNA酶活性参与了哪些与RNA相关的细胞学过程，具有怎样的生物学意义[12]。

2 APE1参与miRNA的剪切成熟，调控下游PTEN基因的表达

APE1能够与部分pri-miRNA特异性结合，很可能是揭开APE1参与RNA代谢生物学意义的重要突破口，也有助于阐明APE1凋亡抵抗的新机制。有研究首次描绘了APE1通过miRNA剪切成熟参与基因表达调控的全景图，发现在受到APE1稳定敲低的HeLa细胞中受到影响最大的是一群与凋亡抵抗、和上皮间充质转化（EMT）相关的miRNA，这与APE1高表达细胞的恶性生物学表型，包括侵袭增殖能力增强及多种抗肿瘤细胞耐药等非常吻合。有趣的是，TELL课题组在肝癌细胞株[13]、骨肉瘤细胞株中[14]发现了一些相似受到APE1调控的 miRNA，包括 miR-221、miR-10b、miR-484和miR-4443，与肿瘤对放化疗的敏感性相关。我们通过RNA亲和沉淀测序（RIP-seq）实验发现，APE1与多个RNA序列有明确的、稳定的结合，其中包括primiR-221和pri-miR-222。随后，我们在多种肿瘤细胞株中证实了过表达APE1可以显著增加与pri-miR-221和pri-miR-222结合作用。更为有趣的是，敲低APE1可以显著增加HeLa细胞中pri-miR-221/222的表达，但是却抑制了成熟的miR-221/222水平，这项结果提示，APE1与pri-miR-221/222的结合极有可能显著促进其成熟过程，从而阻遏下游靶基因介导的凋亡启动。该结果首次确证了APE1可以与miRNA的前体稳定结合，可能在miRNA加工成熟中具有重要的调控意义。

根据APE1的RNA酶活性特点，我们发现APE1在部分miRNA剪切成熟过程中发挥了类似RNA酶Ⅲ的作用，促进了miRNA的成熟。RNA酶Ⅲ是一类特异性识别双链RNA的RNA酶，经典的miRNA加工过程中主要是依靠2个RNA酶Ⅲ：DROSHA和DICER1。DROSHA主要是识别pri-miRNA上的茎环结构与侧翼的单链RNA交界部位，通过辅助的因子DGCR8/PASHA进行剪切，形成pre-miRNA。而DICER1主要是识别pre-RNA的两端，分别剪切环状结构和部分双链RNA区域，形成配对的双链miRNA。目前，有证据显示，在多种肿瘤组织中都有全局性miRNA的下调，然而pri-miRNA却多数呈高表达[15]，随后的研究也证实，DROSHA和DICER1在多种肿瘤中呈现低表达或者突变，被认为是导致全局性miRNA下调的主要原因。值得关注的是，在存在DROSHA和DICER1介导的经典miRNA成熟机制存在缺陷的肿瘤中，仍有小簇miRNA上调，其中包括很多具有抗凋亡、促增殖及促进EMT功能的oncomiR。目前，对于这些miRNA上调的分子机制仍不清楚，推测可能与肿瘤中存在未知的miRNA加工成熟机制有关。前期研究显示，APE1的RNA酶活性能够行使剪切功能的区域主要位于单链RNA和非严格配对的双链RNA[16]。前期发表在生化领域著名杂志Journal of Molecular Biology上研究显示，APE1在DNA的茎环结构与单链DNA的交界区域有显著的活性[17]。鉴于miRNA前体剪切过程中形成与茎环状DNA类似的结构，我们推测APE1对于茎环结构RNA也可能有活性。APE1与miR-221/222前体耦合的主要生物意义在于其快速发挥RNA酶活性促进miR-221/222的剪切和成熟。具体来说，我们发现APE1作用的位点在：（1）pri-miRNA单链侧翼区发挥类似于DROSHA酶的剪切作用；（2）pre-miRNA环状结构的末端发挥类似于DICER1酶的剪切作用。另外，我们发现敲低APE1可以显著增强miR-221/222靶基因抑癌基因PTEN的表达，降低磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的水平，这一结论在多种肿瘤的临床样本库中得到了验证。

3 研究的临床意义及科学价值

肿瘤是目前影响人类健康最重要的恶性疾病，其发病率和病死率都高居榜首。尽管目前大量的新药，包括分子靶向药物正在加速进入临床，但是耐药仍是阻碍肿瘤患者治疗疗效的最大难题。令人遗憾的是，在肿瘤领域对APE1参与耐药的机制，特别是其影响的miRNA及其进一步调控的耐药基因仍然不得而知，亟待深入研究。经过前期大量的筛选和验证工作，目前已经有针对APE1不同活性的小分子抑制剂，包括针对其DNA修复活性的CRT0044876、InhibitorⅢ等，以及针对其转录调控活性的小分子抑制剂E3330。参与本研究的3个课题组，在前期也针对其转录活性筛选出基于中药天然产物库的棉酚、依布硒、丹参酮ⅡA等，以及针对APE1与NPM1结合的小分子抑制剂。值得注意的是，目前美国印第安纳大学的MARK KELLEY教授已经将APE1的抑制剂E3330按照临床药物成药性进行优化改构（命名为APX3330），已经在胰腺癌等癌种进行Ⅰ期临床试验。本研究通过探索APE1在特定的miRNA剪切成熟及代谢过程中的详细分子机制，重点针对多种耐药肿瘤细胞模型和耐药临床标本队列，研究APE1对miRNA的影响并调控下游靶基因表达的通路在多种抗肿瘤治疗耐药中的关键作用，聚焦APE1的RNA酶活性在体内外实时监测与APE1的小分子抑制剂，在肿瘤耐药逆转中的联合策略研发。通过研究APE1参与凋亡抵抗的新机制，以期阐明其RNA酶活性的重要生物学意义，有助于阐明APE1参与miRNA剪切成熟的普遍规律，发现oncomiR加工成熟的新机制，同时为克服肿瘤的治疗抵抗，提高临床治疗疗效提供科学依据。

4 研究带来的新问题和未来研究的方向

有研究表明，APE1在RNA代谢过程中的作用，不仅仅局限于调控miRNA的表达。通过RIP测序分析，超过1 000个转录因子可与APE1结合，涉及肿瘤进展的RNA代谢、转录调控及DNA修复的整个过程。研究人员通过对APE1的相互作用组学进行全景描述，发现在HeLa细胞里与APE1相互作用的蛋白中有很多与miRNA剪切成熟相关的蛋白，包括 NPM1、NCL、THRAP3、hnRNPU、PRP19、SFPQ、p53[18]。因此，APE1如何参与miRNA的剪切成熟，是否依赖其他辅助因子仍然值得深入研究。

此外，令人感兴趣的是，人群中存在7种天然APE1蛋白突变体，特别是D148E位点突变与NSCLC的发生及恶性程度相关[19]，很可能具有凋亡抵抗的作用。更令人惊讶的是，这些突变体的DNA修复活性均未受到影响[10]。而TELL课题组发现，D238G、R237C和L104R这3种罕见的APE1突变体可以引起持续的应激反应，并影响肿瘤细胞的增殖，其机制可能是通过改变APE1相互作用组[20]和显著降低其3'-RNA磷酸酶活性[21]。这些APE1的天然突变体是否能够影响与RNA底物的结合能力，催化RNA剪切的活性，进而发挥凋亡抵抗的效应，均为研究者亟待解决的重要科学问题。

目前已开发的APE1检测方法，如酶联免疫吸附测定[22]、电化学免疫测定[23]、电化学发光免疫传感器法[24]、只能应用于体外检测，而且酶联免疫法操作烦琐、成本高，而电化学方法重复性差，且需要对样品进行预处理，难以实现复杂生物样品中APE1的一步快速检测。核酸荧光探针方法具备操作简单、成本低、设计灵活、响应迅速等优点，已被广泛应用于核酸酶的分析测定[25]。但由于核酸荧光探针易降解且很难进入细胞，如何利用核酸探针实现活细胞内APE1活性的原位实时检测是挑战研究者的难题[26]。