刘 芳 秦双红 赵燕霞

（1．第四军医大学西京医院皮肤科，陕西西安710032；2．第四军医大学西京医院病理科，陕西西安 710032；3．解放军第518医院，陕 西西安 710043）

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球最常见的恶性肿瘤中排名第5，每年有超过70万的新发病例，年死亡人数高达25万人[1-2]。 既往研究[3-4]认为，HCC的发生、发展多由于遗传与环境因素间相互作用，是一个由多诱因、多基因参与、多步骤调控的复杂过程，但其具体的发生机制仍不明确。肝癌的发病机制十分复杂，但是肝癌与脂代谢的研究已成为近年来人们关注的焦点。

肝细胞内中性脂质(neutral lipids)主要贮存在脂滴(lipid droplet，LD)中。现有研究表明，脂滴并非仅仅是细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器，可能在脂质代谢、储存、转运、蛋白降解及信号转导中起着重要的作用[5-6]。作为脂质中心及能量代谢的枢纽，脂滴的生物学研究越来越受到学者们的重视。肝脏是人体最重要脂肪代谢器官，大多数内源性脂质和载脂蛋白均由肝脏合成，正常生理条件下维持脂代谢的稳态。固醇调节元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c)是肝脏内脂肪合成基因的重要转录调节因子，近年来研究发现其在调控肝癌等多种肿瘤脂肪代谢方面发挥着重要的作用[7-9]。因此，我们通过应用慢病毒载体构建SREBP-1c 过表达细胞模型，为今后进一步研究脂滴代谢对HCC 生物学行为的影响及分子机制提供基础实验工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株和细胞 慢病毒载体系统购自美国Addgene网站，包括psPAX2(Addgene plasmid 12260)、pmD2.G(Addgene plasmid 12259)；质粒pLenti6.3/V5、pENTRTM- 3C、重组酶(Gateway LR ClonaseTMII)和大肠杆菌DH5α购自Invitrogen公司；Blasticidin购自Sigma 公司。质粒pLenti 6.3-mCherry由第四军医大学生化教研室惠赠。质粒pCMV5-HA-SREBP-1c由清华大学生命科学院周林康博士惠赠。293T细胞及小鼠肝癌HepG2细胞由本实验室保存。

1.1.2 主要酶和试剂 Taq酶、限制性内切酶EcoR I、Not I、T4 DNA连接酶、DNA marker和Prime STAR②Max DNA Polymerase均购自TaKaRa公司。脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。小提质粒试剂盒和胶回收试剂盒购自宝生物工程大连有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SREBP-1c基因的提取及鉴定 按照SREBP-1c基因序列(GenBank登录号NM 011480.3)，设计SREBP-1c全长的引物，由北京奥科生物技术公司合成。序列如下：F，5´-CGGAATTCATGGACGAGCTGG CCTTC-3´(EcoR I，划线部分为酶切位点)；R，5´-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGCTGGAAGTGACGGT CCT-3´(Not I，划线部分为酶切位点)。以质粒pCMV5-HA-SREBP-1c为模板进行PCR反应，62 ℃退火15 s。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，然后按照胶回收试剂盒说明书回收DNA片段。用EcoR I和Not I分别对SREBP-1c和质粒pENTRTM-3C进行双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，将目的和载体片段进行胶回收，用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细菌。收集菌体沉淀，按质粒小提试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。经过酶切鉴定的阳性克隆，送北京奥科生物技术公司进行测序。

1.2.2 重组慢病毒载体pLenti6.3-SREBP-1c的构建及包装 对测序正确的质粒pENTR-3C-SREBP-1c进行载体重组。将pENTR-3C-SREBP-1c质粒和目的载体pLenti6.3用LR ClonaseTMII酶和蛋白酶K在37 ℃孵育。电泳鉴定后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态

细菌，小量培养筛选出菌株。按质粒小提试剂盒说明书提取质粒，酶切鉴定。北京奥科生物技术公司测序鉴定。将鉴定正确的重组质粒pLenti6.3-SREBP-1c 4 μg、PsPAX2 3 μg、pmD2.G 1 μg的混合液与Lipofectamine 2000溶液轻柔混匀，待其形成DNA-脂质体复合物后，共转染至293T细胞中。37 ℃孵育48 h后收集上清液，使用0.45 μm滤器过滤，收集病毒上清液，计算pLenti6.3-SREBP-1c病毒液的滴度后分装-80 ℃保存。同样方法制备慢病毒对照组pLenti6.3-mCherry。

1.2.3 筛选稳定表达SREBP-1c和mCherry的HepG2细胞 将HepG2细胞铺于6孔板中，使细胞密度为2×105/mL，培养至细胞汇合度达到30%～50%时开始进行病毒感染，将病毒液和高糖DMEM培养液按1∶1 比例混合，每孔加入2 mL混合培养液。先用带有红色荧光的pLenti6.3-mCherry病毒上清分别按不同浓度加入每孔细胞培养液中，感染48 h，荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达，以估测感染效率。用感染效率最高且对细胞状态影响最小的病毒量感染靶细胞。2 d后更换为含有10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞长满后加入含有3 μg/mL Blasticidin的培养液2 mL，每3～4 d更换该培养液直至阴性对照孔细胞全部死亡。经过10～14 d的筛选后，我们获得了稳定表达SREBP-1c的HepG2细胞株，同法筛选稳定表达mCherry 的HepG2细胞株。

1.2.4 Real-time PCR检测SREBP-1c mRNA的表达

根据目的基因设计Real-time PCR引物，引物由北京奥科生物技术公司合成，序列如下：F，5´-GGAGCCA TGGATTGCACATT-3´；R，5´-GCTTCCAGAGAGGAG GCCAG-3´。按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA，用Prime Script RT试剂盒将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR，检测SREBP-1c mRNA表达量的变化，确认SREBP-1c过表达的细胞株。应用SYBR®Premix Ex TaqTMII(Perfect Real Time)试剂盒进行Real-time PCR。按SYBR®Premix Ex TaqTMII(2×) 12.5 μL，PCR 上、下游引物(10 μmol/L)各1μL，cDNA 1 μL，dH2O(灭菌蒸馏水)9.5 μL，总体系25μL配制PCR反应液(反应液配制在冰上进行，以两步法进行PCR扩增，95 ℃预变性5 min，95 ℃、5 s，60℃、30 s，72 ℃、30 s，40个循环，最后60 ℃延伸30 s，相对定量计算公式：倍数变化=2－△△CT。

1.2.5 Western blot检测SREBP-1c蛋白的表达水平

将HepG2细胞、转染SREBP-1c和mCherry的HepG2细胞分别接种到25 cm2的细胞培养瓶中(约106个细胞)。培养至细胞汇合度约90%后吸弃培养液，0.25%胰蛋白酶消化收集并用PBS洗涤1次。加入RIPA细胞裂解液冰浴裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清。用Bio-Rad Protein Assay进行蛋白定量。稀释至同样浓度后加入1×上样缓冲液，煮沸变性。随后取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，接着将蛋白电转至PVDF膜上，将PVDF膜浸于含5%脱脂奶粉的PBST中，室温摇床上缓摇封闭1 h。封闭后用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。相应的一抗以1∶1 000稀释，将膜置于一抗中4 ℃过夜。次日，室温复温1 h，用PBST洗膜3次，每次5 min。再加入二抗，以1∶5 000稀释，将膜置于二抗中室温摇床上缓摇1 h。用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min。ECL显色液显影，压X光胶片，常规显影定影。

1.2.6 检测SREBP-1c过表达对HepG2细胞内脂滴的

影响 在稳定表达SREBP-1c及阴性对照的HepG2细胞中加入200 μmol/L的油酸刺激24 h后检测脂滴：①Hoechst 33258细胞核染色。先将1 mg的Hoechst 33258溶解于5 mL的0.01 mol/L PBS中，配制成储存液，终浓度为500 mg/L；使用时用PBS以1∶50～1∶100稀释后染色细胞，37 ℃ 作用10 min，PBS洗3次，每次5 min。②Bodipy 493/503中性脂质染色。首先将1 mg的Bodipy 493/503溶解于1 mL的无水乙醇中，配制成终浓度为1 mg/mL的储存液；使用时用PBS以1∶100稀释后染色细胞，37 ℃ 作用10 min，PBS洗3次，每次5 min。防荧光淬灭封片剂封片，采图。③肝细胞内甘油三酯含量的测定。吸弃培养液，用PBS洗涤细胞两遍，然后加入胰酶消化细胞，再用含有10%胎牛血清的培养液终止消化，并均匀吹打细胞，将各孔细胞悬液分别移入离心管中，采用Folch法抽提脂肪，利用氮气干燥有机相，用1 mL氯仿/甲醇(2∶1)重新溶解。利用薄层色谱法分离甘油三酯，标准品通过Bio-Rad公司的图像采集系统和Quantity One软件进行定量分析。

1.3 统计分析

2 结果

2.1 载体pENTR-3C-SREBP-1c的构建和鉴定

以质粒pCMV5-HA-SREBP-1c为模板，进行PCR反应后得到3 406 bp (SREBP-1c全长)片段(图1)，连接进入pENTRTM-3C质粒中，阳性克隆用EcoR I和Not I双酶切鉴定后送测序。测序结果显示与GenBank 公布序列一致。

图1 PCR扩增SREBP-1c基因电泳结果

2.2 重组载体pLenti6.3-SREBP-1c的构建和鉴定

进一步将构建成功的pENTR-3C-SREBP-1c质粒和pLenti6.3质粒进行重组，EcoR I和Not I双酶切鉴定后送测序(图2)。测序结果证明我们成功的构建了pLenti6.3-SREBP-1c的全长质粒。

图2 慢病毒载体的PCR鉴定

2.3 重组慢病毒的PCR扩增鉴定

将重组后的慢病毒载体及包装质粒利用Lipofectamine2000转染293T细胞，分别于转染24和48 h后收集上清培养液，过滤后得到重组慢病毒。同法制备mCherry对照组病毒悬液，包装成功的293T细胞可见红色荧光蛋白表达。收集培养皿中的细胞，提取RNA，反转录成cDNA后以此为模板扩增获得SREBP-1c寡核苷酸序列(图3)。

2.4 建立稳定表达SREBP-1c的HepG2肝癌细胞株

为了排除病毒系统对肝细胞的影响，我们构建了SREBP-1c稳定表达的HepG2细胞系。加入含有10 μg/mL Blasticidin的DMEM培养液1 d后，各组细胞开始出现死亡。10 d左右，阴性对照组细胞全部死亡，pLenti6.3-SREBP-1c和pLenti6.3-mCherry均有少量细胞存活，继续筛选至14 d，此时收集细胞。以pLenti6.3-mCherry为对照组，Western blot结果显示，pLenti6.3-SREBP-1c慢病毒感染的HepG2细胞内SREBP-1c的蛋白表达水平比对照组提高3.2倍。Real-time PCR的结果证实，在SREBP-1c稳定转染的细胞中，SREBP-1c的mRNA水平较对照组升高了约11.4倍(P＜0.01，见图4)。这些均证明我们成功构建了SREBP-1c稳定表达的HepG2细胞株。

图3 重组慢病毒的PCR鉴定

2.5 SREBP-1c过表达对HepG2细胞内脂滴的影响

Bodipy493/503荧光染料显示肝细胞中的脂滴，结果发现SREBP-1c过表达能够明显增加肝细胞内脂滴的数量和大小。肝细胞内甘油三酯定量结果显示，其甘油三酯含量是对照组的3.2倍(P＜0.01，见图5)。

3 讨论

脂代谢与多种信号转导通路密切相关，参与调节细胞的生长、增殖、分化、凋亡、炎症、运动及膜平衡[10]。脂代谢紊乱可以改变细胞膜的构成及通透性，导致多种疾病的发生和发展[11]， 如肿瘤[12]、 糖尿病[13]、心脏病[14]等 。Ackerman等[15]研究发现脂肪酸代谢能为肿瘤的发生发展提供赖以生存的微环境。同时，也有研究表明脂代谢异常参与调控多种肿瘤的恶性表型[16]。

HCC是全球高发病率和死亡率的恶性肿瘤之一。最近研究表明，非酒精性脂肪肝，特别是非酒精性肝炎与HCC的发生密切相关[17-18]。这些数据提示HCC中肝细胞脂质代谢异常，脂质代谢紊乱可能是HCC发生发展的关键环节之一[19]。

脂滴作为脂代谢的核心细胞器，能够特异地储存中性脂质，其数目和大小与脂代谢的平衡有着十分密切的关系。脂代谢的调控十分复杂，与多条信号转导通路密切相关。其中，固醇调节原件结合蛋白(SREBPs)在调节脂肪细胞合成、脂肪酸自稳态和组织细胞脂肪沉积方面起着关键作用[20-21]，SREBPs高表达可以导致脂肪合成相关酶基因高表达，造成脂肪在非脂肪组织中堆积。SREBPs由Briggs等[22]在1993年首次发现，并且成功分离。SREBPs是具有“碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链”(basic h elix-loop- h elix-leucine z ipper，bHLH-ZIP)结构的核转录因子超家族，广泛分布于哺乳动物的肝脏、白色脂肪组织、肾上腺及乳腺组织等处[23]。迄今为止，在哺乳动物中发现SREBPs包含SREBP-1a， SREBP-1c及 SREBP-2三 种 异 构 体 。 其中，SREBP-1c作用于脂肪酸合成酶等靶基因，主要负责调控游离脂肪酸和甘油三酯的生物合成。Beatrice等[8]发现SREBP-1c通过激活Akt/mTORC1信号通路调控脂质合成，影响肿瘤细胞的生长和生存。

图4 携带SREBP-1c的慢病毒在HepG2细胞中的表达

图5 SREBP-1c过表达对HepG2细胞内脂滴的影响

因此，我们构建和使用携带SREBP-1c序列的慢病毒，感染HepG2细胞，建立SREBP-1c基因过表达细胞模型。经Real-time PCR鉴定，筛选出来的过表达细胞株SREBP-1c的mRNA水平升高了约11.4倍。Western blot发现过表达细胞株SREBP-1c蛋白水平比对照组提高3.2倍。免疫荧光显示过表达SREBP-1c能够明显增加HepG2细胞内脂滴的数量和大小，细胞内甘油三酯定量结果显示其甘油三酯含量明显升高。本文通过成功构建的SREBP-1c过表达细胞模型，为今后进一步研究脂滴代谢在调控HCC脂肪代谢过程中的作用和分子机制提供了重要的研究工具。

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