刘萌萌，李彦文，周庆彪，张佳欣，王乐乐，刘江正，于卫华，孔德钦，

刘 瑞，海春旭，张晓迪*

（空军军医大学军事预防医学系毒理学教研室，陕西 西 安 710032）

氯气广泛用于冶金、纸浆漂白、纺织、染料、橡胶、塑料等工业生产，由于管理不善或操作不当所导致的群体性急性中毒事件时有发生[1]。肺脏是氯气发挥毒效应的第一靶器官，高浓度氯气可深入肺泡，引起急性肺损伤(acute lung injury，ALI），目前缺乏救治药物。研究显示，线粒体在氯气引起的II型肺泡上皮细胞损伤中发挥重要作用，并能影响整个细胞的功能，从而加重ALI[2]，提示改善线粒体功能可能是治疗氯气致ALI的有效途径。PINK1/Parkin是线粒体质量控制系统的关键蛋白，通过影响自噬、离子运输和ATP产量等作用，保护线粒体的完整性[3-4]。红景天苷是一种苯丙素糖苷，自红景天中提取，具有提高运动耐力、抗疲劳、预防高原反应、促进血液循环、清除机体毒素和治疗各种地方病等药理作用。本研究在深入观察氯气致肺血管内皮细胞损伤的基础上，探讨红景天苷对氯气暴露致大鼠急性肺损伤发生中线粒体功能的干预作用，为氯气中毒的临床救治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯气购自常州市京华气体有限公司。二辛可宁酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒和超微量ATPase测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；组织线粒体分离试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司；Tom20鼠多克隆抗体、COX IV兔多克隆抗体、PINK1兔多克隆抗体和Parkin兔多克隆抗体均为美国Santa Cruz Biotechnology产品；β-actin鼠多克隆抗体购于美国Sigma公司；动式染毒柜为天津合普科技有限公司产品。红景天苷购自西安易乐生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物与饲养 实验动物购自第四军医大学动物实验中心，实验动物许可证号为SCXK(陕)2014-002。成年雄性SD大鼠60只，体质量为 (200±20) g，饮用自来水，垫料为锯末，12 h/12 h明暗交替，在染毒前12 h禁食不禁水。

1.2.2 动物分组和处理 36只雄性SD大鼠，氯气暴露前1 d，随机分为6组：分别为未染毒组，以及氯气染毒后0.5、1.5、3、6和9 h组。各染毒组被置于染毒柜中给予氯气1 200 mg/m3暴露处理5 min，未染毒组(给予空气)单独放入干净染毒柜中，5 min后取出，在相应时间取材，腹腔注射2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉大鼠，腹主动脉取血，后行气管插管，结扎右侧支气管，左肺进行肺泡灌洗。将未灌洗的右肺整体取出，右肺中叶用于病理切片制备，其余肺组织置-80 ℃ 保存待用。另外24只雄性SD大鼠，随机分为4组：氯气暴露组，红景天苷干预组，阴性对照组和红景天苷对照组；氯气暴露组和红景天苷干预组氯气染毒条件同上，其余2组未进行染毒处理。红景天苷干预组和红景天苷对照组均于染毒前30 min和染毒后15 min各给予1次300 mg/kg红景天苷灌胃，阴性对照组和氯气暴露组给予等量生理盐水灌胃，3 h后取材。

1.2.3 乳酸脱氢酶(LDH）、Na+, K+- ATP酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力的测定 左肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和全血 2 000 r/min离心10 min，分装后严格按照试剂盒操作步骤，测定LDH活力、Na+, K+-ATP 酶及Ca2+, Mg2+-ATP酶活力，其余部分于-80 ℃保存。

1.2.4 Western blot检测PINK1、Parkin和Tom20蛋白表达 取100 mg肺组织，剪碎后置于匀浆器中，加1 mL裂解液，匀浆后置于冰上裂解30 min，14 770 r/min 离心20 min，取上清，其中 20 μL用于蛋白定量，其余分别加入等体积2×SDS上样缓冲液，100 ℃加热10 min，将样品进行分装，-80 ℃保存，Western blot测定PINK1、Parkin和Tom20蛋白表达，使用Quantity One灰度分析软件进行半定量。

1.2.5 肺组织细胞线粒体超微结构观察 取右肺中叶，4%戊二醛固定肺组织，二甲砷酸缓冲液冲洗后脱

水、环氧树脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染，透射电镜下观察肺血管内皮细胞线粒体超微结构改变。

1.2.6 肺组织线粒体的提取 准确称取200 mg肺组织，PBS冲洗干净，加入线粒体分离试剂后匀浆器匀浆，1 000 r/min离心10 min，取上清，11 000 r/min、4℃离心10 min，弃上清，沉淀即线粒体。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对实验结果进行统计学分析，-实验结果用x±s 表示，组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用 Tukey’s multiple comparison test检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 氯气暴露引起BALF中LDH活力升高

LDH的检测结果见图1，与未染毒组相比，氯气暴露处理不同时间后，大鼠BALF中LDH活力均明显升高，其差均异具有统计学意义(P均＜0.05)。

图1 氯气暴露后大鼠BALF中LDH的变化

2.2 氯气暴露影响线粒体相关蛋白表达

Western blot法检测肺组织中线粒体相关蛋白Tom20、PINK1及Parkin表达结果见图2。与未染毒组相比，Tom20、PINK1及Parkin蛋白表达水平均升高，差异均具有统计学意义(P均＜0.05，Tom20蛋白9 h组除外)。与其他组别相比，染毒后3 h组Tom 20蛋白表达量最高(P＜0.05)，故选取3 h作为后续实验时间节点。

2.3 氯气致肺血管内皮细胞线粒体结构变化

图2 氯气染毒不同时间后大鼠肺组织线粒体相关蛋白Tom20、PINK1及Parkin表达变化

透射电镜检测大鼠肺血管内皮细胞结果见图3。阴性对照组肺组织血管内皮细胞线粒体(图3A、B)形态正常，线粒体呈卵圆形或杆状，分布密集，内嵴清晰且排列整齐，嵴内腔未见扩张，基质均匀一致，未见线粒体肿胀及空泡变性。氯气暴露后3 h(图3C)，肺组织血管内皮细胞线粒体透光度不均，嵴排列紊乱，甚至溶解消失，基质疏松，线粒体肿胀明显且空泡变性(图3D)。

2.4 红景天苷对肺组织线粒体相关蛋白的干预作用

图3 透射电镜下大鼠肺血管内皮细胞线粒体超微结构改变

Western blot检测肺组织线粒体相关蛋白结果如图4。氯气暴露后3 h，大鼠肺组织PINK1和Parkin蛋白表达上调，与氯气暴露组相比，红景天苷可降低PINK1和Parkin蛋白表达水平(P＜0.05)。

2.5 红景天苷对线粒体PINK1和Parkin的干预作用

图4 红景天苷对肺组织PINK1、Parkin蛋白表达的干预作用

PINK1和Parkin主要在线粒体上发挥作用，进一步测定了线粒体中PINK1和Parkin的蛋白表达水平，结果见图5。与阴性对照组相比，氯气暴露后，线粒体中PINK1蛋白表达上调(P＜0.05)，Parkin蛋白表达下降(P＜0.05)；与氯气暴露组比较，红景天苷干预能够显著降低线粒体PINK1蛋白表达(P＜0.05)，升高Parkin蛋白表达水平(P＜0.05)。

2.6 红景天苷对肺组织ATP酶活力的干预作用

定磷法检测ATPase活力结果见图6。与阴性对照组相比，氯气损伤后 3 h，引起肺组织Na+, K+-ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶活力升高(P＜0.05)。红景天苷干预可显著使其活性降低(P＜0.05)。

2.7 红景天苷对血清LDH活力的干预作用

大鼠血清LDH活力变化情况如图7。氯气染毒后3 h，氯气暴露组LDH活力显著高于阴性对照组(P＜0.05)；与氯气暴露组相比，红景天苷干预可显著降低因氯气损伤引起的LDH活力异常(P＜0.05)。提示红景天苷对氯气致急性肺损伤具有保护作用。

3 讨论

氯气是一种刺激性气体，进入机体后，常与黏膜和呼吸道的水作用生成氯化氢和新生态氧，引起上呼吸道黏膜炎性水肿、充血和坏死[5]。氯气中毒至今缺乏有效救治药物，瓶颈问题是中毒机制不清楚。本研究在大鼠染毒实验中发现，氯气损伤后可致肺血管内皮细胞线粒体受损，线粒体相关蛋白表达呈现时间效应关系，并且染毒后3 h变化显著。结合文献[6-8]报道，推测在氯气致大鼠急性肺损伤过程中，线粒体损伤可能是其发生的重要环节和损伤机制。线粒体是真核细胞内重要的氧化代谢场所，其膜上的呼吸酶类可通过电子传递链传递电子，消耗O2，产生ATP。生理状态下，线粒体传递电子是高效的，仅有少量电子漏出，形成ROS。有研究报道，氯气暴露后，次级代谢产物Cl/HClO/ClO-可直接作用于线粒体，损伤电子2链，引起内源性ROS增多，并且消耗抗氧化物质，导致氧化应激[9]。本研究发现氯气损伤过程中线粒体结构和功能均发生显著变化，这种变化是否是由过多的ROS所导致的，尚需进一步实验验证。红景天苷被认为是红景天中最有效成分[10]，分子式为C H O，亲水14 20 7强，不易透过组织生物膜[11]，半衰期短，与组织有较高的亲和性，可提高机体对氧的利用系数和对缺氧的耐受性，起到保护肺组织和心血管的作用[11]。红景天苷还是良好的抗氧化剂，能够清除自由基，抑制脂质过氧化物形成，延缓细胞的退行性变化。本文尝试应用红景天苷这种优良的抗氧化剂验证改善氧化损伤的同时，是否可修复线粒体损伤。

图5 红景天苷对肺组织线粒体中PINK1和Parkin蛋白表达的干预作用

图6 红景天苷对肺组织ATP酶活力的干预作用

图7 红景天苷对大鼠血清LDH水平的干预作用

PTEN诱导假定激酶1 (PINK1)是一种核编码的丝/苏氨酸激酶，在细胞质中产生，转位至线粒体发挥作用[12-13]。当细胞发生应激时，PINK1转位至线粒体外膜，以一种磷酸化的作用方式偶联Parkin，从而维持线粒体膜的完整性和膜电位的稳定。PINK1/Parkin是线粒体质量控制系统的重要调节因子[12，14]，具有保护细胞线粒体的功能。由于线粒体是细胞内主要的产能细胞器，因此PINK1/Parkin对于细胞的活性也至关重要。PINK1的变异会导致激酶活力下降，影响自噬、氧化磷酸化和糖酵解水平[15-16]，Parkin可以与线粒体DNA 直接结合，保护线粒体 DNA并激发线粒体的自我修复过程[17]。本研究发现，氯气暴露引起肺组织PINK1与Parkin蛋白表达水平升高，这可能与线粒体数量增加有关；氯气暴露引起线粒体PINK1转位水平升高，偶联Parkin下降，线粒体自噬水平下降，这与Zhang等[18]的研究结果一致，原因可能是受损线粒体增多，机体清除率下降[19]；红景天苷干预可有效降低线粒体PINK1转位水平，升高线粒体Parkin水平，说明红景天苷可保护线粒体，这与张伟等[20]的研究结果一致，原因可能是，红景天苷通过维持PINK1和Parkin功能，促进失活线粒体的降解，抑制因氯气暴露引起的线粒体数量升高。

肺泡表面存在ATP依赖的Na+, K+- ATP酶和Ca2+, Mg2+-ATP酶，在ALI进程中发挥重要作用[21]。氯气暴露后，次级代谢产物进入细胞直接作用于线粒体，干扰氧化磷酸化过程，引起ATP产量下降，影响ATPase 活性，导致肺泡离子运输紊乱。肺泡上皮的Na+, K+-ATP 酶，将Na+离子从肺泡腔转移到肺泡间质，当肺泡上皮轻微受损时，Na+, K+-ATP酶被激活，可在一定程度上限制肺水肿的程度[22]， 随着损伤加重，Na+, K+-ATP酶逐渐失活。Ca2+, Mg2+-ATP酶与钙稳态失衡密切相关。氯气暴露后，ATP能量供应异常，Ca2+, Mg2+-ATP酶功能异常，引起细胞外Ca2+内 流和细胞质Ca2+超载，引起离子代谢紊乱，导致肺水肿。本研究观察到，氯气暴露引起ATP酶活力升高，离子运输紊乱，这与Qin等[21]结果一致，红景天苷干预可显著降低ATP酶水平，提示红景天苷对线粒体有保护作用。

LDH存在于人体各组织器官中，是机体能量代谢中的一种重要酶，其质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢。当机体各组织器官病变时，其组织器官本身的LDH活力发生改变，并且可引起血液中LDH活力改变，因此LDH活力的改变反映了机体受损的程度。氯气暴露后，肺组织LDH被释放进入血清和BALF中，LDH活力水平可间接反映肺损伤程度。本研究结果发现，氯气暴露引起LDH活力升高，红景天苷能够有效抑制LDH活性的升高，提示红景天苷可有效保护氯气引起的大鼠ALI。

综上所述，氯气暴露引起大鼠肺血管内皮细胞线粒体受损，致细胞供能障碍，肺血管功能异常，进而导致急性肺损伤。红景天苷可改善氯气所致的大鼠ALI，其机制除了改善氧化损伤外，还可能通过抑制线粒体过度增殖，同时促进受损线粒体的清除来发挥作用。本研究为红景天苷药物药效学研究及氯气中毒的有效救治提供了基础数据与理论依据，为红景天苷的药物开发提供了有意义的参考。

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