罗海恩+毛新展

[摘要] 目的 探讨NF-κB p65基因沉默对类风湿性关节炎滑膜HFLS-RA细胞增殖及凋亡的影响。 方法 采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000转染NF-κB p65的siRNA至HFLS-RA细胞中，利用RT-PCR和Western blot技术分别检测HFLS-RA细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达情况。噻唑蓝MTT法和流式细胞仪检测细胞的增殖率和凋亡率。 结果 与空白对照组和阴性对照组比较，转染siRNA后的HFLS-RA细胞中NF-κB p65 mRNA、蛋白表达量和细胞增殖率均明显下降，而细胞凋亡率明显升高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 NF-κB p65基因在类风湿性关节炎滑膜HFLS-RA细胞的增殖和凋亡过程中起着重要作用，使其沉默后能够抑制滑膜HFLS-RA细胞增殖，诱导其凋亡。

[关键词] 类风湿性关节炎；滑膜细胞；NF-κB；细胞增殖；细胞凋亡

[中图分类号] R593.220.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（b）-0008-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of NF-κB p65 gene silencing on proliferation and apoptosis of rheumatoid arthritis synovial HFLS-RA cells. Methods NF-κB p65 siRNA was transfected into HFLS-RA cells by cationic liposome LipofectamineTM2000， and the expression of NF-κB p65 mRNA and protein in HFLS-RA cells was detected by RT-PCR and Western blot respectively. The proliferation and apoptosis of HFLS-RA cells were separately detected by MTT and flow cytometry assay. Results Compared with the blank control group and the negative control group， the expression of NF-κB p65 mRNA， protein and cell proliferation rate in the HFLS-RA cells transfected with siRNA was decreased， while the apoptosis rate was increased， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. Conclusion NF-κB p65 gene plays an important role in the proliferation and apoptosis of synovial HFLS-RA cells in rheumatoid arthritis， and silencing its expression can inhibit the proliferation of synovial HFLS-RA cells and induce its apoptosis.

[Key words] Rheumatoid arthritis； Synovial cells； NF-κB； Cell proliferation； Cell apoptosis

類风湿性关节炎（RA）是一种病因未明的复杂的自身免疫疾病。滑膜成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）过度增生是RA最显著的特征之一，在RA的发生发展过程中起着重要作用[1-2]。因此，寻找抑制滑膜细胞增殖或促进凋亡的作用靶点，可有效缓解或治疗RA病。NF-κB是一种广泛的真核细胞核转录因子，调控着多种基因的表达，与机体的多种生理病理疾病密切相关[3-4]。研究发现，NF-κB在RA滑膜炎性反应中起着重要作用[5-6]，但其具体的作用机制研究较少。本研究采用阳离子脂质体转染NF-κB p65的siRNA，观察NF-κB p65基因沉默对滑膜细胞HFLS-RA增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原代滑膜HFLS-RA细胞购于美国Cell Applications公司，胎牛血清FBS和DMEM培养基购自美国Hyclone公司，鼠抗NF-κB p65单克隆抗体、β-actin抗体和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗购于英国Abcam公司，ELx808酶标仪购于美国Bio Tek公司，TaqDNA聚合酶、DNA marker DL2000和PCR引物购自上海生工生物工程有限公司。LipofectaminTM2000转染试剂购于美国Invitrogen公司。TRIzol提取试剂盒和M-MLV 逆转录试剂盒购于美国Gibco公司，Bio-Rad凝胶电泳成像仪购于美国 PE公司，CO2培养箱购于美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将HFLS-RA细胞培养在含15%FBS的DMEM培养基（包含100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素）中，在37℃、5%CO2的培养箱常规培养。2～3 d传代1次，传至第5代时取对数期细胞进行实验。

1.2.2 siRNA转染与分组 在转染前1 d，以3×104个/孔的细胞密度接种于标准的6孔板中，培养基为高糖型DMEM培养液。待细胞融合度达到70%左右时，按照LipofectaminTM2000说明书的实验步骤，利用脂质体将siRNA转染至HFLS-RA细胞中。实验分为无任何处理因素的空白对照组，脂质体法转染阴性对照siRNA的阴性对照组和预转染NF-κB/p65 siRNA的siRNA转染组（siRNA转染的终浓度为45 nmol/L）。每组实验重复5次。endprint

1.2.3 NF-κB P65 mRNA和蛋白的表达 ①采用RT-PCR检测NF-κB p65 mRNA的表达水平。转染24 h后，按照TRIzol提取试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA，使用ELx808酶标仪检测总RNA的浓度和纯度，按照M-MLV逆转录试剂盒说明书进行逆转录，以cDNA为模板进行PCR扩增，其中NF-κB p65的引物参照Zhang等[7]实验：上游引物5′-GGGAAGGA？鄄ACGCTGTCAGAG-3′；下游引物5′-TAGCCTCAGGG？鄄TACTCCATCA-3′，扩增片断204 bp；内参照β-actin上游引物5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，下游引物5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′，扩增片断132 bp。PCR扩增条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃1 min，72℃ 45 s，30个循环，72℃ 10 min。取PCR产物10 μL琼脂糖（浓度为1.5%）凝胶电泳，以Bio-Rad凝胶电泳成像仪摄像，以β-actin为内参，以目的基因灰度值与β-actin灰度值的比值计算目的基因片段的相对表达量。②采用Western blot检测NF-κB p65蛋白的表达。收集转染24 h后的各组细胞，加入裂解液提取总蛋白，使用BCA法检测蛋白浓度。取上清蛋白量100 μg进行12% SDS-PAGE凝胶电泳、转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，特异性一抗（鼠抗NF-κB p65单克隆抗体和β-actin抗体）4℃孵育过夜，山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育2 h后，ECL显色，经Bio-Rad凝胶电泳成像仪采集。以β-actin为内参，收集条带用Image Pro Plus软件进行灰度定量分析。

1.2.4 细胞增殖实验 收集转染48 h的对数期HFLS-RA细胞，经胰消化酶（0.25%）消化细胞后以1×104个/孔细胞浓度接种到96孔板上，置于37℃、5%CO2条件下培养24 h，实验仍以空白对照组、阴性对照组和siRNA转染组，每组设5个复孔，继续培养24 h和48 h后，弃培养液后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，4 h后加入200 μL DMSO，充分溶解后，使用酶标仪在570 nm处检测各组的吸光值OD。计算出各组细胞的增殖抑制率，增殖抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%。

1.2.5 细胞凋亡实验 收集上述实验中转染48 h的对数期的各组HFLS-RA细胞，调整细胞浓度为5×103个/mL，经预冷的PBS洗涤后，加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，加入5 μL膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素（Annexin-V-FITC）和10 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10 min后，上流式细胞仪检测各组细胞的细胞凋亡率。其中每组实验均设5个重复。

1.3 统计学方法

实验中的数据资料采用Graph Pad Prism软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达

荧光定量分析各组HFLS-RA细胞结果（图1）显示，NF-κB p65 mRNA空白对照组、阴性对照组和siRNA转染组的mRNA的相对表达量分别为（0.431±0.028）、（0.410±0.042）和（0.206±0.035）。与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA转染组的NF-κB p65 mRNA表达量明显降低（P < 0.05）。阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。Western blot检测结果（图2）显示，siRNA转染组的NF-κB p65蛋白的相对表达水平（0.336±0.042）明显低于空白对照组（0.752±0.056）和阴性对照组（0.715±0.048），差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 各组细胞增殖抑制率的变化

MTT法检测各组HFLS-RA细胞结果显示，空白對照组、阴性对照组和siRNA转染组的增殖抑制率均随时间的延长而增大；相同作用时间下，与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA转染组的增殖抑制率明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），但空白对照组和阴性对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.3 各组细胞凋亡水平的变化比较

流式细胞仪检测结果（图3）显示，空白对照组、阴性对照组和siRNA转染组的细胞凋亡率分别为（9.12±2.16）%、（12.20±3.58）%和（20.20±4.85）%。与空白对照组和阴性对照组比较，siRNA转染组的细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；阴性对照组与空白对照组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

3 讨论

RA是一种严重的常见慢性自身免疫性疾病，表现为关节和关节周围组织的非感染性炎症，最终导致关节坏损或畸形。Vaubel首次从实验室中培养出滑膜细胞，并将其分为巨噬样滑膜细胞和成纤维样滑膜细胞[8]。研究发现，成纤维样滑膜细胞与RA滑膜病变密切相关，滑膜组织异常增生是RA的主要病理特征[9-10]。研究类风湿性关节炎滑膜细胞增殖及凋亡的机制具有重要意义。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指利用双链RNA，通过碱基互补配对使目的基因沉默的技术，目前该技术具有高效性和高特异性性等特点，被广泛应用于遗传学疾病、肿瘤和抗病毒等研究，并成为靶向基因治疗的有效工具[11-13]。

NF-κB是一种由Sen和Baltimore在小鼠B淋巴细胞中发现，在炎症、免疫反应中占中心地位的快反应转录因子，参与了炎性反应、免疫应答、细胞增殖及凋亡等基因的表达，并且在慢性炎性反应过程中起着关键性作用。NF-κB p65是NF-κB中最重要的功能性亚单位之一，可反式激活多种基因调节细胞的增殖及凋亡。Luo等[14]通过下调NF-κB p65发现可促进HeLa细胞的增殖及侵袭能力。Zhang等[7]发现沉默NF-κB p65表达可抑制肺腺癌细胞株A549增殖并诱导其凋亡。Wang等[15]研究发现靶向沉默p65基因可抑制人乳腺癌细胞增殖，促进细胞凋亡。有研究发现，TREM-2基因和CTGF基因沉默对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭和凋亡有一定的影响[16-17]。为探讨NF-κB p65基因沉默是否影响滑膜细胞的增殖及凋亡，本研究将NF-κB p65小干扰RNA转染后，检测到滑膜HFLS-RA细胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达水平均受到明显的抑制，结果显示所采用的siRNA成功沉默目的基因表达。本研究采用MTT法和流式细胞仪检测了转染48 h后滑膜HFLS-RA细胞的增殖抑制率和凋亡率的变化。结果发现，siRNA转染组的增殖抑制率明显降低，凋亡率明显升高。表明NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA细胞增殖和诱导其凋亡，并提示p65基因可能是治疗RA的潜在靶点。endprint

综上所述，NF-κB p65基因沉默可抑制滑膜HFLS-RA细胞增殖，诱导其凋亡，为研究和治疗RA提供理论依据。

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（收稿日期：2017-09-01 本文編辑：张瑜杰）endprint