苏华+陈琛+张斌

[摘要] 目的 对超声检查疑为短肢畸形的胎儿进行致病基因成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）全外显子突变分析产前基因诊断及遗传咨询。 方法 从UCSC Genome Bioinformatics数据库中提取包括FGFR3基因全部17個外显子的2个转录本的相关序列作为标准序列，设计合成FGFR3全基因外显子扩增的共8对引物。收集2014年1月～2016年12月在河北北方学院附属第一医院就诊的5例疑为短肢畸形的胎儿，对高危胎儿于B超引导下行羊水穿刺，富集细胞，对FGFR3基因外显子组进行PCR扩增，应用Sanger基因测序技术进行FGFR3基因全外显子测序，采用CodonCode Aligner软件对测序结果进行错义突变位点分析，判断其是否存在致病突变。 结果 5例疑为短肢畸形的胎儿，其中1例胎儿FGFR3基因（转录本NM_000142.4）第7号外显子（FGFR3-7-IS1）携带错义突变C.1138G>A（P.Arg380Gly），其余4例未发现FGFR3基因突变。对明确了致病突变的5例孕早期胎儿家属进行遗传咨询。 结论 对疑似短肢畸形胎儿应用基因测序技术进行产前FGFR3基因突变的检测可以预防短肢畸形患儿的出生。

[关键词] 短肢畸形；软骨发育不全；成纤维细胞生长因子受体3；突变；产前诊断

[中图分类号] R714.53 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（b）-0016-04

[Abstract] Objective To identify the fibroblast growth factor receptor 3 （FGFR3） mutation of fetuses with short limbs deformity and carry out genetic counseling by fetuses found in ultrasound screening. Methods The genomic information of FGFR3 full 17 exon amplification from UCSC Genome Bioinformatics， including 2 genome transcripts were extracted as a standard sequence， 8 pairs of primers were designed. 5 fetuses suspected to be with short limb deformities in the First Affiliated Hospital of Hebei North University from January 2014 to December 2016 were selected and the amniotic fluid of the fetuses in high-risk was collected for detection of mutation of FGFR3 gene by polymerase chain reaction and Sanger gene sequencing. The mutation of the sequencing of FGFR3 gene was carried out by CodonCode Aligner software. Results Among the 5 fetuses with short limbs deformity， 1 case was carried mutations C.1138G> A （P.Arg380Gly） on the 7th （FGFR3-7-IS1， transcript NM_000142.4）. FGFR3 mutation were not found in the other 4 cases. Genetic counseling was conducted on 5 cases of fetal parents. Conclusion The detection of prenatal FGFR3 gene mutation in suspected patients using gene sequencing could effectively prevent the birth of short limb deformity patients.

[Key words] Short limb deformity； Achondroplasia； Fibroblast growth factor receptor-3； Mutation； Prenatal diagnosis

胎儿四肢骨骼发育异常是常见的出生缺陷之一，主要的临床表现以四肢不同程度的肢端短小为主，多见于染色体的异常及各种综合征。产前的超声排畸检查仅能给出提示而不能进行诊断，使遗传咨询的进一步处理困难重重，因此，对超声排畸发现的短肢畸形胎儿尽可能的明确诊断，可为遗传咨询提供准确依据。成纤维细胞生长因子受体3（fibroblast growth factor receptor-3，FGFR3，OMIM 134934）基因被认为是与肢端发育异常相关的基因[1]，其突变所致的肢端发育异常疾病包括软骨发育不全（achondroplasia，ACH）、致死性骨发育不良、成骨发育不全等。FGFR3基因突变发生位点的不同，可导致疾病发生的不同及程度的不同[2]。本研究对5例疑为短肢畸形的胎儿进行致病基因FGFR3全外显子突变分析产前基因诊断及遗传咨询。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月～2016年12月在河北北方学院附属第一医院（以下简称“我院”）就诊的5例疑为短肢畸形的胎儿，获得孕妇本人或家属知情同意的情况下经B超引导行羊水穿刺，收集羊水细胞，进行FGFR3基因突变筛查。本研究经我院医学伦理委员会通过并获得家属知情同意。endprint

1.2 一般情况

5例疑为短肢畸形的胎儿，其中4例为24～28周胎儿进行B型超声排畸检查，疑似短肢畸形的胎儿。1例孕母为临床确诊为ACH的患者，具有ACH典型的临床表现[4]，身材矮小且不成比例，四肢短且粗，躯干細长，头大、前额突出、塌鼻梁，肘关节不能伸直，双腿呈“O”型，腰椎前突，手指短小具有典型的“三叉手”，临床表现和放射学检查符合ACH。对其胎儿行超声排畸检查发现胎儿具有ACH典型临床特征：巨头，与胎儿孕龄不符，枕骨大孔小，额部隆起，胎儿近端肢体进行性变短，四肢长骨短小，骨化差，骨后方声影不明显，胸腔狭小，肋骨细短，腹部或有膨隆并伴腹水，椎骨骨化差伴低回声，孕妇可伴有全身水肿，羊水过多等，该孕妇于孕25周自愿进行FGFR3产前基因检测。所有病例均经B超引导行羊水穿刺，收集羊水细胞，常规试剂盒提取DNA[血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（DP304）购自天根生化科技有限公司]，-20℃保存待检。野生型对照标本取自我院体格正常的健康体检者静脉抗凝血。

1.3 FGFR3全外显子基因检测方法的建立

从UCSC Genome Bioinformatics数据库（http：//www.genome.UCSC.edu）中提取FGFR3基因全部17个外显子的核酸序列，包含全部2个转录本（FGFR3IS1：NM_000142.4；IS3：NM_001163213.1）的相关序列作为标准序列，设计并合成FGFR3基因PCR扩增引物共8对（见表1），应用Takara PT600梯度PCR仪对FGFR3基因外显子组进行PCR扩增，反应总体系为25 μL，GC缓冲液Ⅱ 12.5 μL，1.25 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L引物各0.75 μL，LA Taq聚合酶（大连宝生物工程有限公司）1.25 U，基因组DNA模板0.5 μL（核酸浓度均在20～78 ng/μL，微量核酸浓度检测仪侧得吸光度A值为1.8～2.0）。PCR反应条件：95℃预变性4 min，93℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，确定产物片段大小是否与预期一致，并送公司测序（北京美吉生物技术有限公司）。

1.4 FGFR3突变筛查

对5例疑为短肢畸形的胎儿及其父母进行致病基因成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）全外显子突变分析，测序结果用CodonCode Aligner软件寻找突变位点，并通过HGMD数据库及FGFR3基因数据库对有意义的突变位点进行筛选。

1.5 遗传咨询

根据FGFR3基因检测结果对5例受试胎儿家属进行遗传咨询，告知胎儿父母胎儿患ACH可能性大小，指导胎儿父母进行是否继续妊娠。

2 结果

2.1 FGFR3全外显子基因检测方法的建立

成功设计8对特异性引物，建立了FGFR3全外显子基因检测方法，对FGFR3基因两个转录本的17个外显子基因进行PCR扩增，片段长度符合预期，1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

2.2 FGFR3 基因突变检测

对5例短肢畸形胎儿脐血和1例正常对照全血DNA进行FGFR3基因全外显子组测序，发现1例孕母诊断为ACH患者的胎儿其FGFR3基因（转录本NM_000142.4）第7号外显子（FGFR3-7-IS1）发生杂合突变c.1138G>A（p.Gly380Arg），结果见图2A；野生型测序结果见图2B。其余4例未检出FGFR3基因突变。

2.3遗传咨询

得知FGFR3基因测序结果后，4例胎儿FGFR3基因无突变发生，未携带C.1138G>A（P.Arg380Gly）突变，将来为ACH患者的可能性小，经遗传咨询后其孕母及家属选择继续妊娠。1例先天携带ACH致病突变C.1138G>A（P.Arg380Gly）胎儿，其孕母及家属在得知产前诊断结果后，通过遗传咨询最终选择终止妊娠。

3 讨论

FGFR3基因是肢端发育异常最主要的致病基因，FGFR3基因定位于人类染色体4p16.3，包含17个外显子，全长16.5 kb，编码806个氨基酸的蛋白质分子，分子量为110 000～135 000 D[3]。FGFR3是酪氨酸激酶受体，是具有骨骼调节发育功能的跨膜蛋白，FGFR3受体蛋白包括3个部分：即胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成，①胞外区为3个免疫球蛋白样配体结构域组成（分别为IgⅠ、IgⅡ、IgⅢ），是糖基化的配体结合区，能与成纤维细胞生长因子发生作用，影响细胞的有丝分裂；②跨膜区是一个疏水区，跨膜1次，没有可磷酸化的酪氨酸；③胞内区为近膜区和2酪氨酸激酶区（TK1和TK2）构成。FGFR3与其配体FGFs结合后，FGFR3发生二聚化，使酪氨酸激酶激活，胞内区下游含SH2结构域的信号分子和丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶磷酸化，进而激活细胞核内转录因子，进一步调节基因的转录和蛋白的表达[4-6]。

研究显示，95%的ACH由FGFR3基因c.1138G>A（Gly380Arg）突变引起（其他罕见突变包括S84L、R200C、N262H、G268C、Y278C、V381E[7-9]），为常染色体显性遗传，该突变位于FGFR3蛋白跨膜区[10-11]。Zhou等[12]发现FGFR3蛋白跨膜区的G380R氨基酸发生突变使蛋白活化过程中形成二聚体更容易，可持续活化胞内区的酪氨酸激酶，从而激活胞内的信号传导途径，使软骨细胞增殖和分化发生障碍，导致骨骼生长受限。Di Rocco等[13]通过小鼠动物模型Fgfr3（Y367C/+）观察到，FGFR3基因突变导致FGFR3蛋白超活化，使受体过度降解，软骨细胞增殖分化受到抑制，导致骨膜成熟障碍，是ACH发生的主要原因。有研究发现[14]，ACH的发生与父亲年龄可能相关，随着父亲年龄的增长，精子生成时影响DNA复制、修补的因素可使精子细胞突变的机会增加。endprint

直接針对热点突变的筛查可以排除95%的ACH，但少数罕见突变难以被发现，建议对肢端发育异常患者进行FGFR3全基因组突变筛查。Makrythanasis等[15]报道了1例严重的骨骼发育异常患者，临床表型为脊柱歪斜，突出，“三叉戟”样手，不能行走，该例患者首次发现了NM_000142.4：c.1637C>A：p.（Thr546Lys）突变，该突变位于FGFR3蛋白胞内激酶区，是季肋发育不全的突变热点区域，因此FGFR3全基因外显子突变的筛查对所有肢端发育异常患者的疾病诊断都是有重要意义的。

ACH是完全外显的常染色体显性遗传，建议对B超诊断为肢端短小疑为ACH患者的胎儿已经不能仅仅停留在临床监测的水平，还应进行FGFR3突变基因的产前基因诊断[16-17]。本文通过FGFR3全基因外显子组测序的方法，实现高危胎儿产前基因诊断，结果显示，5例短肢畸形胎儿，其中1例孕母诊断为ACH患者，其胎儿携带FGFR3基因c.1138G>A（p.Gly380Arg突变，父母通过遗传咨询选择终止妊娠；其余4例父母均为野生型，胎儿未检出FGFR3基因突变，经遗传咨询后将来为ACH患者的可能性小，选择继续妊娠。建议父母身材矮小的胎儿（侏儒症的除外）应引起重视，适当选择产前FGFR3突变热点及全基因外显子突变筛查[18-19]。产前突变筛查样本包括胎儿羊水中提取DNA、绒毛膜绒毛细胞DNA、脐带血淋巴及单核细胞DNA等[20]。方法除测序外也可采用PCR-高分辨率溶解测定法快速检测热点突变位点[21]。本研究强调FGFR3基因突变检测在肢端发育异常胎儿产前诊断中的重要性，高危胎儿进行FGFR3产前基因突变筛查，可有效预防患儿的出生，实现优生优育。

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（收稿日期：2017-09-01 本文編辑：任 念）endprint