戴颖

瓦房店市中心医院检验科 （辽宁 瓦房店 116300）

乙肝病毒（HBV）是一种危害性较大且具有传染性的一类病毒。它进入人体后会很快复制，病毒对肝脏损害严重的会导致肝硬化腹水、肝癌，直接威胁患者生命[1]。HBV在传染期有较大的活跃性，传染性也很强，如果使用科学有效的检测手段能在病毒复制的早期就将其找出并使用有效的医疗方法控制病毒，可以大大减少HBV在人群中的传播，对于已经感染了HBV的患者可以早期进行对抗病毒的治疗，防止病情恶化，改善患者的预后结局。在以往的临床检测中，常常用到PCR检测，但纳米探针技术有更高的检测效率，灵敏度也很好[2]。本文通过实验分析纳米探针技术检测的优势，现报告如下。

1.资料与方法

1.1 一般资料

纳米金溶液，粒径为（15±3.5）nm，基因芯片（上海百奥公司），0.2x柠檬酸钠缓冲液SSC，含1g/L十二烷基硫酸钠（SDS），银染液和硝酸钠（NaNO3）洗液均由本实验室自行制备[3]；Taq DNA连接酶和Taq连接酶缓冲液（美国Biolabs公司）；杂交液（瑞士罗氏公司）；所用试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水（18.3MΩ/cm）；实验所需探针序列均由大连TakaRa公司合成。

Prosys5510A型芯片点样仪（美国Cartesian Technology公司）[4]；V-670型紫外可见分光光度计（美国Jasco公司）；DGG-9053A型恒温干燥箱（韩国Sumsung公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（TEM日本电子公司）；BX51型显微镜（日本Olympus公司）[5]。

1.2 方法

选择待检测的乙肝病毒DNA备用。应用探针标记技术、跟踪技术达到定量检测病毒中的DNA数量的目的。纳米金探针1号是信号探针，和病毒DNA一端连接，纳米金探针2号是检测探针，和1号探针连接。另外选用磁珠探针1号作为捕捉探针，在检测病毒DNA含量时，纳米金探针和磁珠探针将DNA的靶序列夹在中间，形成一个三明治样的整体结构[6]。然后再利用磁场作用将三明治结构分离，并从原溶液中分离，然后浸入DDT溶液，再将信号探针从纳米金颗粒上洗脱。洗脱出的信号探针的数量直接反应了DNA靶基因的多寡，将检测探针和捕捉探针2号分别连接在信号探针的两端，然后浸入银染液，检测探针显色，得到靶目标的DNA相对定量信息。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0对所得资料进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，两组比较P＜0.05表示有显著统计学差异。

2.结果

经过标记后的纳米金颗粒视野下更加清晰，颗粒直径变大，且大小基本相同，颗粒的稳定性与分散性更好。游离的碱基外露的DNA纳米探针金溶液在波长为520nm处有最高吸收峰，而与巯基非特异结合后在波长525nm处有最高吸收峰。

纳米金探针1号溶液按不同倍数稀释成不同的浓度梯度后，检测得出稀释1倍的探针浓度（6.6nmol/L）信号几乎无变化，故将其定为用量；同样方法得出探针2号的稀释倍数2倍信号变化不大，浓度为4.6nmol/L，将其定为浓度用量。检测HBV DNA浓度低至8fmol/L时，杂交实验不显色，或色弱，检测的最低浓度值为8fmol/L。

3.讨论

单链的DNA在纳米金表面吸附性更强，非特异性吸附竞争激烈，更容易结合，巯基与碱基迅速结合，探针金颗粒直径变大，杂交率提高，影响了溶液的吸收波，色谱图峰值偏移。信号探针杂交实验可以准确定量到不同浓度梯度，不会造成检测溶液的浪费，同时精准检测结果，当浓度到达一定阈值后，会有明显的减弱效果，所以可以测出这种方法最低检测浓度值，增加了结果的可靠性和充分性，为临床诊断提供更为科学的数据支持[7]。杂交实验相较于其他纳米金探针染色更为直接、简单易行，而纳米金探针技术的杂交不但汲取了传统杂交实验的优点，同时信号强度的放大和精准定位，提高了传统方法检测的效率和灵敏度，银染效果更强，检测最低浓度也更低，且节约仪器试剂设备费用，经济效用更强[8]。染色信号捕捉精准，特异性良好，该实验具有一定的独立重复性，误差较小。

[1]汪毅,毛红菊,臧国庆,等.纳米探针芯片技术用于微量乙肝病毒DNA的检测[J].分析化学,2014,38(8):1133-1138.

[2]毛红菊,金庆辉,赵建龙,等.用于微量核酸检测的纳米探针芯片的研制及在乙肝病毒耐药基因突变检测中的应用[C].2008年全国纳米生物和医学学术会议论文集,2015:96-98.

[3]邢亚斯,邹能利,毛红菊,等.基于双纳米金探针杂交法检测HBV DNA[J].高等学校化学学报,2012,33(7):1420-1425.

[4]李玮,庞代文,王业富,等.目视化乙肝病毒基因芯片[J].高等学校化学学报,2013,24(12):2186-2188.

[5]S Wang,L Li,H Jin,et al.Electrochemical detection of hepatitis B and papilloma virus DNAs using SWCNT array coated with gold nanoparticles[J].Biosensors & Bioelectronics,2013,41(1):205-210.

[6]BH Cha,SM Lee,JC Park,et al.Detection of Hepatitis B Virus (HBV) DNA at femtomolar concentrations using a silica nanoparticle-enhanced microcantilever sensor[J].Biosensors & Bioelectronics,2009,25(1):130-135.

[7]忻亮.基于金纳米微粒的化学发光特定序列DNA分析[D].复旦大学,2015.

[8]习东,宁琴,卢强华,等.Au纳米颗粒HBV DNA基因探针的制备及其在目视化检测HBV DNA中的应用[J].中国生物医学工程学报,2016,25(1):30-34,40.