罗志荣，蔡 昊，王强利，牟芳芳，邵水金，国海东

（上海中医药大学基础医学院：1人体解剖学教研室，2组织胚胎学教研室，上海201203）

0 引言

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是造成人类死亡的主要原因。在我国，CVD占所有死亡人数的45%左右。其中，急性心肌梗死（acute myo⁃cardial infarction，AMI）因其突发性和高致死率、高致残率，已成为全世界范围内的一个重大公共卫生问题。心肌梗死后心肌细胞发生凝固性坏死，并在细胞间隙中出现水肿和中性粒细胞浸润。坏死的肌细胞被巨噬细胞清除，并最终被胶原瘢痕所代替［1］。

快速有效地恢复血流是减少梗死面积的最佳治疗方案。然而，高达60%的AMI患者仍可能发生心肌重构。目前的常规治疗，包括药物、介入或外科手术，均不能挽救已经坏死的心肌细胞，从而导致整个心脏的大小、形状、结构和功能发生变化［2］。近十几年来，干细胞领域的快速兴起与发展为AMI的治疗带来了新的希望。干细胞治疗AMI的可能机制包括直接向心肌和血管内皮细胞分化、促进血管新生或旁分泌途径。其中，干细胞移植后经旁分泌途径保护受损心肌，促进骨髓和／或心脏内干细胞迁移到损伤部位已成为近年来研究的焦点［3］。

过去十几年，已有多种干细胞用于临床前动物模型和临床试验，包括骨髓单核细胞（bone marrow mononuclear cell，BM⁃MNC），骨骼肌成肌细胞，内皮祖细胞，间充质干／基质细胞（mesenchymal stem cells，MSC），心脏干细胞（cardiac stem cells，CSC），胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESC）和诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）等。 大部分动物实验研究发现，心肌梗死后，干细胞移植可促进心肌再生，提高心功能。临床试验表明，干细胞治疗可以改善心脏功能，减少梗死面积和死亡率［4－5］。 然而，也有部分临床试验［6］证明，干细胞移植并未让心肌梗死患者受益。然而，在干细胞疗法最终应用到临床之前尚需解决或完善诸多关键问题，包括细胞来源、细胞体外培养、移植细胞的数量、移植途径、移植后在宿主体内的存活和分化、免疫排斥等。

1 干细胞来源和类型

到目前为止，已有多种来源的干细胞用于临床试验，包括外周血、BM、心脏活检组织、脐带血和脂肪组织。其中，自体BM⁃MNC是最常见的用于治疗AMI的干细胞类型。BM⁃MSC由于其易于从人体组织中分离以及多向分化潜力和低免疫原性而获得了较多的关注［7］。CSC具有更好地向心肌分化的能力，但CSC培养具有侵袭性（需要心脏活检），且需要较长时间的体外培养才能获得足够数量的细胞。近来，iPSC及其衍生细胞如心肌细胞代表了新的心脏再生细胞来源［8］。然而，在用于AMI患者的大规模试验之前，需要明确并解决其致瘤性和分化形成的心肌细胞的成熟性。

细胞的健康状态是选择干细胞来源的重要因素之一。老年人CSC丧失自我更新能力，端粒缩短或功能障碍，进入不可逆的静止状态［9］。并且，在每个细胞分裂期间，存在老化细胞可能无法纠正的有害DNA突变的风险［10］。除了年龄之外，还存在其他限制细胞再生潜力的影响因素。譬如，与健康人相比，从糖尿病和高血压患者或终末期心脏病患者分离的CSC 扩增能力明显下降［11－12］。

对不同干细胞治疗的作用进行比较和评估，是今后临床筛选合适干细胞类型的依据之一。有研究［13］比较了 BM⁃MSC与 BM⁃MNC的作用，并提出在改善局部心脏功能和减少梗死面积上，BM⁃MSC比BM⁃MNC更有优势。此外，心脏的形态发生十分复杂，包括多种不同的谱系提交的细胞类型。除心肌细胞之外，促进梗死区平滑肌细胞和内皮细胞的再生也是十分有价值的。然而，临床试验需要明确两个不同类型干细胞联合使用时可能的不良反应［13］。为了研究最佳的干细胞组合，CSC和MSC联合移植已被用于猪的移植实验［14］，并且至少有两项研究正在进行临床Ⅰ和Ⅱ期试验（NCT02501811和NCT02503280）。

2 体外培养

目前干细胞移植治疗AMI还没有建立标准化的细胞培养方案。不同的培养方法导致细胞的均一性、纯度和效力都不同。另外，细胞来源个体的性别、采用不同的试剂、从不同的位置分离细胞都可能影响细胞的数量、纯度和功能。 Seeger等［15］对 REPAIR⁃AMI［16］与 ASTAMI［17］试验进行比较，发现在 ASTAMI中使用Lymphoprep而不是Ficoll梯度离心导致总细胞数的恢复减少30%，包括CD34＋细胞和MSC。从心房获得的CSC和来自心室的CSC具有差异基因表达和功能特性［18］。因此，在进行任何临床试验之前，需要建立统一的细胞培养方案，包括对细胞的状态、纯度和功能等进行鉴定［19］。

3 细胞数量

细胞数量的多少是影响干细胞疗效的一个关键问题。理论上，需要足够多的功能性心肌细胞才能获得较为理想的治疗作用。目前的研究中，细胞数量差别较大，在 1×106到 2×108之间［20］。 在实践中，为了达到完全的心脏再生，可以移植大量的心肌细胞或较少数量的具有高增殖能力的前体／干细胞。一些临床研究如 PROCHYMAL［21］，ACT34⁃CMI［22］，AMR⁃1［23］和POSEIDON［24］试验表明，低细胞数量比高剂量获益更好。移植大数量的细胞可能导致细胞聚集体的形成，从而导致不良反应，如心律失常［25］。然而，高度增殖细胞的注射也有可能形成肿瘤的潜在风险。此外，高增殖能力的前体／干细胞在移植微环境中能否保持较高的增殖能力，以及是否很快发生分化都是需要阐明的问题。

4 移植方式

到目前为止，临床研究采用的细胞移植途径主要有以下三种：心肌内（intramuscular，IM）注射，经冠状动脉（intracoronary，IC）和静脉（intravenous，IV）注射［26］。这三种移植途径各有优劣，究竟哪种移植方式最佳尚未达成共识。此外，不同细胞类型、疾病急缓状态、患者年龄和体质以及有无其他危险因素都会影响 移 植 途 径 的 选 择。 REGENERATE⁃IHD［27－28］（NCT00747708）和 Alster⁃MACS（NCT01337011）临床试验的结果将有助于阐明在慢性心力衰竭患者IC或IM之间的优劣。

IM途径可以通过开胸或通过心内膜导管将细胞直接注射到心肌［29］。一般将细胞注射到梗死周边区域，以确保细胞有足够的血液供应维持存活。这种方法的优势是有较多的细胞被移植入病变部位。然而，有可能导致一些副反应，例如心肌穿孔、血管损伤、栓塞和室性心律失常的风险［29］。

IC途径是将细胞注射到冠状动脉循环中，包括使用标准经皮冠状动脉导管。这种方法与IM途径相比更具有优势，因为它具有低侵袭性，并且有助于注射细胞相对均匀分布，并且细胞生存率也更高（因为细胞注入有氧气和营养供应的心肌区域）。因此，这种方式在临床相对容易操作和推广。然而，IC途径仍然具有一定缺点，例如通过体循环到达其他组织器官，而进入心肌的细胞数量不多［30－31］。 另一个重要的缺点是可能导致冠状动脉栓塞，尤其是注射大直径细胞（50～200 μm）时。

有些临床试验也采用了IV途径。该方法操作最简便，不会对患者造成损伤。但是大部分细胞潴留在肺中或被网状血管上皮系统清除［30］。因此，在采用IV注射时，如何增强移植细胞向病变部位迁移和募集值得深入研究和探讨。

5 存活和分化

干细胞在移植后能够在心肌内停留并存活下来是细胞疗法最关键的一步。动物实验［32－33］和临床试验［34－35］发现，在移植后 24 h，只有不到 10%的细胞留存下来。而移植4周后，心脏中仅检测到1%移植的细胞［36］。大部分细胞可能被血液循环冲洗、从注射部位溢出以及细胞死亡。细胞死亡（包括坏死和凋亡）的原因可能包括：炎症、缺氧、酸中毒、缺乏底物和代谢物累积的缺血缺氧微环境；被吞噬细胞吞噬。

目前，提高细胞移植后存活的策略主要包括：①基因修饰：如转染抗细胞凋亡基因如 AKT［37］或Bcl⁃2［38］。 ②生物材料：通过纤维蛋白胶、自聚肽纳米纤维等生物材料构建移植混合物或细胞片［39－40］。预处理：细胞移植前通过 eNOS增强物质［41］、他汀类［42］、缺氧［43］或热休克［44］预处理以提高细胞存活。

存活的干细胞能否有效向心肌细胞分化是心肌再生的主要问题。BM⁃MNC和MSC等移植后向心肌细胞分化效率极其有限。ESC和iPSC向心肌细胞分化的效率较高，但其安全性尚未得到有效评价。目前，多数学者认为，干细胞移植后可能主要通过旁分泌途径发挥改善心脏功能的作用。尽管如此，干细胞向心肌细胞分化并替代受损的心肌仍是干细胞疗法的主要目的，如何提高干细胞向心肌细胞分化值得进一步研究。此外，干细胞移植后向血管内皮细胞、平滑肌细胞、淋巴管内皮细胞的分化也具有较为重要的意义。

6 细胞排斥

自体干细胞是最理想的干细胞来源，因为它不存在免疫反应。然而，自体干细胞移植最大的缺陷在于它在体外培养和鉴定需要较长一段时间，无法用于AMI的治疗，这极大地限制了它的应用。

同种异体间移植最值得关注的问题就是细胞免疫排斥反应，它可能直接影响细胞疗法的最终效果。尽管 MSC 具有免疫豁免的特性［45－46］，但有研究［47］报道其分化以后又重新获得免疫原性，这可能在一定程度上解释了MSC效果不佳的原因。在解决细胞免疫排斥方面，有以下几种策略：HLA供体⁃受体匹配［48］；使用免疫抑制剂，但具有较大的副作用［49］；与免疫排斥有关的基因修饰［50］；使用化学或生物材料降低免疫反应［51］。此外，细胞储存、细胞示踪、移植时机、移植次数以及患者特征等也将在一定程度上影响干细胞治疗的效果。

7 展望

尽管干细胞移植对心肌梗死治疗有较好的应用前景，然而，在细胞来源和体外培养、移植细胞的数量、移植途径和时机、移植后在宿主体内的存活和分化、免疫排斥等方面尚不规范，也未建立相应的可控的标准，这些都会影响干细胞治疗的效果。同种异体移植的细胞来源选择性较大，质量容易控制，并且可以储存，能够满足急性应用。因此，同种异体移植应该是心脏再生医学最主要的方式。尽管到目前为止，该领域还存在诸多的问题需要解决，但干细胞疗法对于心肌梗死以及梗死后心力衰竭仍是最有希望的治疗手段。在解决目前存在的问题的基础上，相信在不久的将来，干细胞疗法最终将成为临床上应用于心肌梗死等缺血性心脏病的有效而成熟的治疗方式。

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