崔永春，祁 磊，李 波，罗晓康，罗承良，王 欣，唐 跃

（1中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心，阜外医院心血管在体实验及评价中心，心血管植入材料临床前研究评价北京市重点实验室，心血管疾病国家重点实验室，北京100037；2苏州大学医学部法医学系，苏州215123；3哈佛医学院布莱根妇女医院神经外科系，波士顿马萨诸塞州02115）

0 引言

外泌体（exosome，Exo）是细胞向胞外分泌的囊泡类小体，直径为30～150 nm，具有典型的脂质双分子层膜结构，存在于细胞培养上清液、血浆、血清、唾液、尿液、羊水和恶性腹水以及其它生物体液中。在机体多种生理病理过程中发挥重要作用，是近些年来生物医学领域研究的热点问题［1-3］。随着基础和临床研究技术的发展，外泌体的面纱正在被层层拨开，对它的认识也在逐渐深入。本文将对外泌体的相关研究进展作一综述，全面了解外泌体独特的生物学结构、功能及其潜在的转化途径，不仅有助于进一步了解细胞的基本生理代谢和病理改变，而且对临床疾病的诊断和治疗也有重要的指导意义。

1 外泌体的生物起源、运输与释放

外泌体的生成是一个连续性的过程。首先，细胞外物质或细胞膜蛋白经内吞形成早期内体（early endosomes），经细胞内运输逐渐成熟为晚期内体（late endosomes），在某种生理病理条件下，晚期内体的界膜多处向内凹陷，形成蛋白运输与分拣中心-多囊体（multi-vesicle bodys， MVBs）。 在 MVBs的形成过程中涉及了20多种囊泡分拣蛋白，其中最重要的是4种内体运输分拣复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）和液泡蛋白分选因子（vacuolar protein soaing 4，Vps4）。 MVBs既可以与溶酶体融合，其内容物经溶酶体降解排出细胞外，也可以内出芽方式形成管腔内的囊泡（intralumenal vesicles，ILVs），直接与胞膜融合，在ESCRTⅢ型收缩及剪切芽颈帮助下脱落，释放入细胞外环境，形成外泌体。释放至细胞间质的外泌体会再次通过内吞作用或配体-受体识别模式进入受体细胞，将“货物”释放入受体细胞胞质后，发挥信号传导作用，也可以重新形成 MVBs或直接与细胞质膜融合，进行下一个循环［4］。

2 外泌体的生物学特点

外泌体外膜富含胆固醇、鞘脂、神经酰胺、糖脂GM3和长饱和脂肪酰基的甘油磷脂链，在细胞微环境中发挥重要作用。广泛分布于人体各种体液。来源于不同细胞的外泌体表面携有相似的保守蛋白，如MHCⅠ类和／或Ⅱ类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白（如 CD9、CD63、CD81、Alix、Tsg101）、整合素、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类［5-7］。

外泌体内部载有母细胞特异性生物学物质，如胆固醇、蛋白质、mRNA、microRNA等生物信息。这些物质不仅能够反映其来源细胞类型，更重要的是，还与其来源细胞的生理功能或病理改变密切相关。最早时，外泌体只被认为是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白，但在最近数年研究中发现，外泌体所携带的“货物”具有重要的生物学意义，尤其外泌体所包含的许多RNA分子已被证实会参与肿瘤发生、病毒感染、神经退行性等重要疾病过程。

正是外泌体的这些表面蛋白和内部包含的特异性生物学物质决定外泌体具有异质性、稳定性的特征，此外，外泌体含有特殊的信号通道，所以还具有靶向性和运输性的特点。外泌体的这些生物特性为外泌体的体外研究、临床应用提供了可能［8］。

3 外泌体的生物学功能

来源于不同细胞的外泌体在不同的生理、病理阶段具有不同的功能。现已知的外泌体作用分为以下两方面。①母细胞：质量控制，选择性释放细胞内有害物质，维持细胞内环境稳态，保持细胞活力。②受体细胞：作为多种信号的传递体，外泌体介导细胞-细胞之间的信息交流；既可近距离影响邻近细胞，也可远距离进行系统调控。

4 外泌体的发展历程及几次重大突破

1986年，Eberhard G．Trams和 R．M．Johnstone在体外培养的绵羊红细胞培养液上清中首次发现了一种有膜结构的小囊泡，并将其命名为Exosome（外泌体）。随后的10年，外泌体并未受到足够的重视。1996年，Raposo等报道了关于EVs功能，阐明了B淋巴细胞通过释放含有Ⅱ型主要组织相容性复合物（MHC）Ⅱ的外泌体诱导的抗原特异性MHCⅡ类限制性T细胞反应，这是外泌体领域获得的第一个重大突破［9］。

此后，研究人员逐渐对外泌体产生了极大的好奇。2007年，Jan Lotvall等创造了外泌体研究的第二个突破，即外泌体内含有的可变RNA如miRNA，非编码长RNA（lncRNA）和mRNA可以在细胞之间转运。在2010年，三个研究小组均证明了这些miRNA可以转移到 standby细胞，并能够在胞内发挥作用［10］。第三个突破是2013年的诺贝尔生理或医学奖获得者：美国科学家James E．Rothman和Randy W．Schekman，德国科学家 Thomas C．Südhof，他们发现了细胞内部囊泡（外泌体等）运输调控机制使外泌体的研究达到全新的高度，成为近些年来生物医学领域研究的热点。

5 外泌体在不同疾病中的研究进展

国内学者对外泌体的研究涉及领域广泛，包括肿瘤外泌体 PKM2［11-15］、人骨髓间充质干细胞［16-18］、血小板外泌体与慢性皮肤损伤［19］、YAP信号通路、GPX1、肝脏损伤［20-22］、心脏损伤［23］、去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer， CRPC）［24］、败血症［25］、乙肝病毒 X 蛋白［26］、Zika 病毒［27］、血管重塑［28］等多系统疾病。下面主要介绍外泌体在几种典型疾病中的研究进展。

5．1 外泌体在肿瘤疾病中的研究进展 目前，已有越来越多的学者研究［11-15］证实，外泌体在肿瘤发生、发展、诊断及治疗等领域发挥重要作用。2015年德克萨斯大学MD安德森癌症中心的一项研究在6月24日的《自然》（Nature）杂志上发布，研究发现存在于癌症外泌体上的glypican-1（GPC1）基因编码蛋白或许可以作为一种潜在非侵入性诊断和筛查工具的组成部分，用来检测有可能适合手术治疗阶段的早期胰腺癌。因此，癌症外泌体不仅是一种生物标记物，而且分离出它们还可为我们提供一个癌症特异性信息的宝库［29］。这些由肿瘤释放的外泌体，在肿瘤患者的体液中是非常丰富的，它们在促进肿瘤生长和进展中起到了关键作用。例如，NCI-H460肿瘤细胞系释放的外泌体中包含EMMPRIN（一种在肿瘤细胞内高表达的跨膜糖蛋白），这种跨膜糖蛋白可以促进成纤维细胞中的基质金属蛋白酶的表达，从而促进肿瘤细胞的侵袭和转移。肿瘤细胞外泌体还含有活性的Wnt蛋白、P-选择素糖蛋白配体1（P-selectin glycoprotein ligand 1），这些蛋白可以调整肿瘤的进展及血栓形成等过程。虽然这些研究成果对于研发阻止肿瘤细胞转移的新治疗方法有重要意义。但是，迄今为止，肿瘤细胞有活性的外泌体是如何释放的机制尚不十分清楚。

2017年1月9日，Nature Communications杂志发表了来自南京大学张辰宇、曾科课题组、南京中医药大学胡刚课题组以及美国佐治亚州立大学Yuan Liu课题组的研究成果，他们发现，PKM2的磷酸化和二聚体化不仅可以转换肿瘤细胞代谢从氧化磷酸化到无氧糖酵解，还可以通过直接磷酸化SNAP23促进肿瘤细胞外泌体的分泌。

5．2 外泌体在神经系统疾病中的研究进展 南京医科大学鼓楼医院徐运教授、基础医学院生理系陈玲教授的研究［30］发现，血清外泌体 miR-9和 miR-124的表达水平有助于诊断急性缺血性卒中和评估缺血性损伤的程度。这项研究的目的是检测急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血清的外泌体浓度的改变和血清外泌体中2个脑特异性miRNAs（miR-9和miR-124）水平的变化，并探讨这些miRNAs在AIS诊断和损伤评估方面的价值。实验发现，与对照组相比，AIS患者血清中的外泌体浓度及外泌体 miR-9和 miR-124水平明显升高（p＜0．01）。 而且，miR-9和miR-124的血清水平与血清IL-6浓度、脑梗死面积、健康卒中量表（NIHSS）分数呈显著正相关。因此，得出结论，血清外泌体miR-9和miR-124的水平有希望作为生物标志物用于诊断AIS和评估缺血性脑损伤程度。但是，对于外泌体在AIS中的作用及作用机制未做深入研究。外泌体在脑卒中疾病中的作用除了是生物标志物外，还有治疗作用［31］。

5．3 外泌体在心血管疾病中的研究进展 心脏在缺血、缺氧、持续高血压刺激后，心肌细胞会经历凋亡和坏死，这是一个导致心脏功能障碍最终心脏衰竭的关键病理过程［32-33］。 大量研究［34-36］表明，干细胞来源的外泌体对心肌梗死及心肌缺血／再灌注损伤引发的心肌细胞凋亡具有非常显著的保护作用。过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源的外泌体富含血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor， PDGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF），也可以通过上调miR-19a，在缺血心肌中起减少氧化应激，减轻炎症伤害［37］，促进血管生成和抗心肌细胞凋亡的作用。阜外医院杨跃进教授在研究中介绍了各类细胞外泌体在干细胞治疗缺血性心脏病中的作用［38］。此外，心肌细胞本身也可以分泌外泌体，此类外泌体富集HSP20，能够通过激活血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2， VEGFR2）促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）增殖，迁移和血管形成［39-42］。

6 外泌体的临床转化潜能及展望

综合分析外泌体的整个生物发生过程、生物学特点以及在不同疾病中的作用机制，外泌体代表了潜在的治疗干预靶标。外泌体临床转化可选择的关键环节包括：外泌体的生物合成或者释放；特定“货物”分拣；外泌体与靶细胞之间的相互作用，或者抑制靶细胞摄取外泌体。展望其今后的临床应用，外泌体潜在的临床转化途径包括两方面。

6．1 母体细胞的生理病理状态生物标志物 外泌体

包含来源于母体细胞的内容物，由于外泌体膜与来源细胞的胞膜具有同源性，可以体现母体细胞的不同生理病理状态。因此，利用胞膜上大量富集的蛋白进行分析能够提高诊断率。目前尿液标本的生物标志物比较常见，比如急慢性肾炎的尿液标志物胎球蛋白

A，较传统的肌苷酸标志物更早出现异常。尿液来源外泌体中活化转录因子可能是急性肾小管损伤的新型生物标记物，肾母细胞瘤抑制基因则可能是慢性肾脏疾病相关足突状细胞特异性损伤标志物。基于外泌体标志物而建立起来的肿瘤诊断新方法有望为临床应用提供更加便捷、准确、灵敏的诊断依据。

6．2 外泌体作为药物载体 外泌体作为一种天然的脂质体还是一种比较理想的药物载体［43］，凭借它自身特有的定向归巢能力，可以穿过细胞膜将所承载的物质运送至靶细胞，能够逃避宿主免疫系统，可被靶细胞特异性吸收。外泌体还能进行膜修饰从而增强细胞特异性靶向作用，例如加载了β分泌酶（betasecretase1，BACE1）siRNA的外泌体可穿过血脑屏障，将大脑神经元、小胶质细胞和少突细胞中BACE1的mRNA及蛋白表达下调60%左右。此外，外泌体还具有足够时长的循环半衰期、无毒性，且能够加载多种不同的药物，是一种很有应用前景的细胞质量控制和疾病防控新工具。

7 外泌体临床转化的局限性

虽然作为生物标志物，外泌体已经初步显示其优越性，但仍有一些问题需要注意。首先，由于外泌体内载物含量较少，因此需要有足够灵敏的检测仪器，才能使外泌体作为生物标志物成为可能。其次，由于体液样本本身也有与外泌体相似组分，因此外泌体的分离和纯化尤为重要。最后，体液中包含来源于各种类型组织和细胞的外泌体，如正常体内提取的血浆外泌体可能来源于红细胞、白细胞或血小板，以及与血液循环直接或间接接触的组织细胞。若想解读血浆来源外泌体所携带的生物信息，需要广大临床和基础研究者继续深入研究，不断发现不同类型细胞特异性外泌体的表型特征，对外泌体来源细胞进行筛选。

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