孙晓远 吴学玲

环状RNA又称环形RNA(circular RNA，circRNA)是一种具有环状结构的长链非编码RNA，广泛分布于类病毒、环状卫星病毒、delta肝炎病毒等。circRNA的特点及功能一直到新近的研究发现才真正被揭示，并且极大程度上改变了我们对肿瘤的看法，尤其是肿瘤的发生发展。到目前为止，研究者们发现了两种主要的circRNA，内含子及外显子circRNA，并且其功能众多。迄今，许多研究阐述了circRNA的特殊作用，其中，circRNA在肿瘤发生及恶性生物学性能中的microRNA海绵作用带给我们对肿瘤发生发展分子机制的全新认识。本文重点阐述circRNA在肿瘤的发生、发展、恶化、转移、复发中的调控作用。这些全新的认知或将为肿瘤治疗带来新的希望。

一、环状RNA的发现及特点

人类基因组中，细胞核与细胞浆中存在大量非编码RNA，包括微小RNA、piwi相互作用RNA、短翻译调控RNA和长链非编码RNA[1]。其中circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，其结构呈闭合环状，大部分在细胞质中富集。2012年，斯坦福大学和霍华德休斯医学研究所的科学家们发表在《PLoS One》上的一项研究首次证实circRNA分子相较于线性RNA分子更普遍地存在于人体细胞的基因表达中。大部分是由外显子序列构成，既在不同物种中具有保守性，又在不同组织、不同发育阶段、不同疾病中具有特异性。由于其闭合环状结构，circRNA对核酸酶具有高耐受性，因而更稳定，该特点使其在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。

1. circRNA的发现： circRNA最先在植物及类病毒中被发现，随后在研究肿瘤抑制基因 DCC、人Ets-1基因及小鼠Sry基因时，发现是从核前体mRNA加工而来[2]。早期，因其特殊环状结构，circRNA对核酸酶稳定，使其检测率较低，故一度认为circRNA在生物中表达水平低下，属于自然界中一种极罕见现象。随着RNA测序和生物信息学等技术的快速发展，circRNA被发现大量存在于真核细胞中，大部分在细胞浆中富集[3-5]。

2. circRNA的形成及分类： 近期研究发现大部分circRNA是在人类上皮间质变迁(EMT)过程中形成的，其中超过三分之一受可变剪切因子Quaking (QKI) 动态调节。鉴于EMT参与肿瘤的发生发展，circRNA或许与肿瘤的发生发育有关[6-7]。

circRNA形成方式表现为外显子环化(exon circularization)和内含子环化(intron circularization)[5, 8-9]。在真核生物细胞中，由内含子及外显子组成的前体mRNA首先在RNA多聚酶II的催化下以辐射状排列的形式在细胞核中合成，后转移至细胞浆中并分离成内含子或外显子。该平衡取决于内含子序列，当与RNA结合蛋白结合时或者当与特定RNA重复序列如CUG及CCUG结合时，可刺激circRNA的产生[10-11]。因此，circRNA也由此分为上述两类，前者较后者更为常见。

3. circRNA的特征： circRNA结构呈闭合环状，对核酸酶具有高耐受性，故而异常稳定；相较于线性RNA分子，更普遍地存在于人体细胞的基因表达[12]；它大部分在细胞质中，少部分在核酸内[13]；circRNA在不同物种中具有保守性，但在不同组织、不同发育阶段、不同疾病中具有特异性。

二、circRNA的功能及与疾病的关系

circRNA并不仅仅是DNA与编码蛋白之间的一个信使，它可通过与相应的miRNA竞争性结合，从而调控靶基因的表达，影响疾病的发生发展。有人将其称之为竞争性內源RNA(ceRNA)，形象地将其比喻为分子“海绵”。近期发现的一个circRNA名为小脑变性相关蛋白 1反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protin 1 transcript, CDR1as)，也称为ciRS-7，在人脑组织中表达丰富，在其序列上有超过70个多个串联的微小RNA-7(microRNA-7，miR-7) 结合位点，起到miR-7的海绵作用，故而调控miR-7靶标基因活性[14-15]。同样，睾丸特异性基因Sry也被证实起到微小RNA-138(microRNA-138，miR-138)的海绵作用。除了ceRNA活性，研究者们认为circRNA也可能与RNA结合蛋白如阿格蛋白结合，或与其它RNA碱基互补结合甚至结合RNA的翻译蛋白，从而调控靶基因的表达[16]。

随着对circRNA认识的加深，人们开始热衷于探讨其与疾病的关系。在斑马鱼实验中，CDR1as 的过表达造成中脑体积减少从而造成中脑发育受损，这一效果与敲除miR-7的效果一致。与此同时，研究发现中脑体积的减少可通过注射miR-7 前体得以部分恢复[17-18]。此外，miR-7因能直接调节a-突触核蛋白表达，故而circRNA可能与帕金森病相关[19]。CDR1as表达下降，miR-7 表达上调，极有可能下调泛素蛋白连接酶A的表达，从而导致阿尔兹海默病的发生[20]。环状ANRIL能通过募集多梳家族( polycomb group, PcG) 来抑制调节INK4/ARF的表达水平，增加动脉粥样硬化的风险[21]。在糖尿病中， miR-7 抑制剂可诱导哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路在胰腺β细胞增殖中的后续刺激效应，至于其中circRNA的作用有待进一步探讨[22]。

三、circRNA在肿瘤中的研究进展

到目前为止，人类已充分认识到miRNA在抑癌或致癌过程中具有重要作用，然而对circRNA在肿瘤中的调控机制却知之甚少。同其他长链非编码RNA等转录物一样，circRNA可竞争性结合miRNA，下调表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 、胰岛素受体底物1 (insulin recept or substrate-1, IRS-1) 、 IRS-2、 p21 蛋 白 活 化 激 酶 -1 (p21-activated kinase-1, Pak1) 、P53及癌基因Raf1 等重要致癌因子的表达，因而在前列腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、恶性胶质瘤、肝癌和乳腺癌等多种肿瘤发生发展中发挥着重要作用[23]。

1. circRNA与肿瘤的发生：研究显示circRNA通过调控microRNA从而调控转录及各种路径[24]，而microRNA可区分诱导性干细胞 (iPSCs) 及胚胎干细胞 (ESCs)，前者在p53网络体系中具有巨大的区分肿瘤细胞的潜能[25]。与此同时，microRNA可通过其表达的上调或下调从而抑制或导致肿瘤的发生。例如，在胃癌患者中miR-222-221 及miR-106b-25集落有明显表达，从而抑制CDK的p21家族的表达，而胃癌患者中miR-125a的表达下降，抑制CDK6，故而细胞发育停滞，细胞凋亡减少[26]。

2. circRNA与肿瘤的发展：研究发现ciRS-7 选择性与miR-7结合，在AGO蛋白的辅助下抑制miR-7的功能，最终从以下三方面抑制EGFR信号通路：①作用于人类EGFR mRNA 3′端未翻译区域中的两个位点；②通过减弱Raf1、PSME3、PLEC1、CKAP4、 CNOT8、 CNN3、 CAPZA1、PFN2/ARF4等基因的转录；③通过抑制 PKB/Akt 10 及ERK1/2的活化。而EGFR的过表达与多种肿瘤包括胃癌、肝癌等的进展有关[27]。另有研究发现ciRS-7可下调miR-7的表达，而miR-7因可与胰岛素样因子-1受体致癌基因结合而表达受抑制，故而抑制了Snail的表达，同时增加了E-钙粘素的表达，部分逆转 EMT，最终阻止肿瘤细胞的转移及增殖，延缓疾病的进展[28]。

在肝癌中miR-7在细胞周期调控中起重要作用，miR-7的表达下降，使得CCNE1基因的沉默减少，导致具有CKD2调控亚基作用的CCNE1复合物增加，从而加速肿瘤细胞G1期向S期的进程[29]；同时也可通过直接作用使PIK3CD、mTOR及p70S6K表达上调，从而加速了肿瘤细胞G0期向G1期的进程，并且通过PI3K/Akt/mTOR信号通路促进肿瘤细胞的迁移[30]。SRY是一种新型环状RNA，通过与miR-138结合而发挥作用。在胆管细胞型肝癌中，SRY抑制miR-138的表达，减少RhoC的转录及表达，导致RhoC/p-ERK/MMP-2/MMP-9通路的活化，从而促进肿瘤细胞的增殖、转移、浸润[31]。

在结直肠肿瘤中，miR-7 的表达下调导致致癌基因YY1的高表达，从而激活p53, 影响下游的p15、 caspase级联反应、C-Jun，并通过活化β-catenin, FGF-4从而激活Wnt信号通路[32-33], 最终导致肿瘤细胞扩增、诱导凋亡等。在小鼠异体移植胶质母细胞瘤中，miR-7可通过干扰PI3K/ATK及Raf/MEK/ERK途径抑制肿瘤新生血管形成[34]。此外，在胰腺癌中miR-7可抑制肿瘤细胞的生长及浸润[35]。在宫颈癌中miR-7通过对FAK通路的调控抑制肿瘤的转移及浸润[36]。因此探索ciRS-7在细胞周期调控中的调控作用必将对肿瘤的治疗带来极大的影响。卵巢肿瘤中，miR-138通过抑制PCNA及Bcl-2通路从而抑制肿瘤细胞增殖，通过SOX4及HIF-1α抑制肿瘤细胞的转移及浸润，而SRY对miR-138的抑制作用，可通过活化Limk1/cofilin通路从而促进卵巢肿瘤的远处转移[37-39]。

四、circRNA在肺癌中的研究进展

随着大气污染的加重，肺癌的发病率逐年上升。手术、放疗、化疗、靶向药物治疗联合应用的个体化综合治疗及针对驱动基因阳性患者的靶向药物的应用，极大改善了肺癌患者的生存期及生活质量，但其总体低治愈率及高死亡率仍严重影响到了肺癌患者的生活质量。然而迄今，罕有circRNA与肺癌的研究报道。目前的研究提示miR-7及miR-138等可能与肺癌的发生发展有关。

近来发现miR-7可通过调控细胞凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, BCL-2) 的表达来抑制人非小细胞肺癌A549细胞的生长[40]；在裸鼠中注入人工表达miR-7的CL1-5细胞后肿瘤体积增加并伴有裸鼠死亡率的增高，揭示了肺癌的出现及其不尽如人意的预后可能与miR-7的过度表达有关；而抑制miR-7可抑制肺癌肿瘤细胞细胞株的增殖并促进其凋亡。也有学者发现在肺癌95D细胞中，TLR9激动剂CpG ODNs可诱导HuR的表达，从而抑制miR-7的表达，促进肿瘤的生长及转移，同时发现通过RNA干扰下调HuR的表达可恢复miR-7的表达，这或许可以在一定程度上治疗肿瘤[41]。在非小细胞肺癌中，miR-138通过作用于H2AX，从而调控肿瘤细胞的DNA损伤修复，研究发现这在一定程度上与肺癌放疗敏感性的增加有关[42-43]。Liu等[44发现KCNJ2/Kir2.1在小细胞肺癌组织中呈高表达(23/52) ，且与其临床分期及化疗反应呈正相关；对多耐药小细胞肺癌细胞进行KCNJ2/Kir2.1基因敲除后肿瘤细胞凋亡增加，细胞周期停止，肿瘤细胞生长受抑制且对化疗药物敏感性增加。同时研究发现该基因的这一作用是由Ras/MAPK通路及miR-7调控MRP1/ABCC1的表达而介导的。Liu等[45]研究发现miR-7与MRP1/ABCC1的表达呈负相关。Li等[46]通过对Lewis肺癌细胞株研究发现miR-7的高表达可下调EGFR及RAF-1致癌基因的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡。在这些复杂microRNA对于肺癌的调控机制中circRNA是否也存在至关重要的作用或将成为今后又一研究热点。

五、circRNA临床应用研究现状及展望

circRNA与microRNA由于已被证实可通过各种小分子及信号通路调控肿瘤的发生发展，故而成为了肿瘤治疗的新型靶点。一般分为两类，一种主要由类似于circRNA结构的人工合成物作用于肿瘤细胞中表达上调的microRNA。另一种是强化原肿瘤中表达减低或生物学活性受抑制的microRNA。

1. circRNA与疾病诊断： Li 等[47]的一项研究纳入了101例胃癌及相应的非肿瘤组织，并对其中36例胃癌术前及术后的血浆采用qRT-PCR方法进行研究，结果显示一种名为Hsa_circ_002059的环状RNA在胃癌组织中的水平明显低于正常对照组(P<0.001)。而在胃癌患者中，手术前后该circRNA在血浆中的水平具有显著差异，并且该差异与其是否远处转移 (P=0.036)及TMN分期(P=0.042)等具有相关性。故而检测该circRNA水平可用于筛查胃癌(ROC曲线下面积为 0.73)。

2. circRNA与疾病治疗及展望： ciRS-7的基因敲除已被证实可使miR-7过度表达，最终导致miR-7目标基因的表达下调。科学家应用质粒或病毒载体实现microRNA的目标片段circRNA的细胞内表达，为肿瘤的治疗带来了新的希望[48]。在结直肠肿瘤中，miR-7表达的下降与西妥昔单抗的敏感性有关，并通过调控EGFR相关信号通路从而导致肿瘤对放疗敏感性不佳[49-50]。HER2阳性的乳腺癌中miR-7可抑制多条致癌通路并保留曲妥单抗体外的抗癌作用。非小细胞肺癌中miR-7可增强其对特殊的药物敏感性[27]。

近期大量circRNA的有关研究证明了其在基因网络调控中是重要的调节因子。由此可见，进一步应用生物信息方法，有效预测circRNA的靶基因、靶位点及体外合成环状RNA，终将为肿瘤的诊疗带来无限新希望。

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