董亚琴 黄倩茹 萨喆燕 万隆 杨广印 陈铭 许金森

基础研究

不同病程心肌缺血损伤大鼠心电图和心肌P2X3受体mRNA表达的对应变化

董亚琴 黄倩茹 萨喆燕 万隆 杨广印 陈铭 许金森

目的 观察异丙肾上腺素（ISO）诱发大鼠心肌缺血时，不同病程模型大鼠心电图和心肌P2X3受体mRNA表达的对应变化。方法 50只大鼠皮下注射60 mg/kg ISO（连续2次，间隔24 h）的方法建立心肌缺血损伤组，并以病程1、2、3、4、5 d再分成5组，每组10只。另选取注射等量生理盐水的大鼠50只作为对照组。运用心电图和qPCR检测方法观察同一病程大鼠心电图波形S-T段和心肌P2X3受体mRNA的表达。结果 随病程进展，模型大鼠心电图波形中S-T段呈先抬高后下降趋势，心肌P2X3受体mRNA的表达亦为先上升后下降，两者显著相关，且差异具有统计学意义。结论 心肌缺血损伤大鼠心肌P2X3受体mRNA的表达增加程度和心电图波形中S-T段抬高幅度明显相关，表明心肌缺血时P2X3受体敏感度显著增强，并参与了心肌缺血的病理过程。

心肌缺血； 心电图； 异丙肾上腺素； P2X3受体

心肌缺血指因心肌血流灌注量不足，引起心肌供氧缺乏及心肌能量代谢异常，进而无法正常运行的一种状态。心肌缺血严重危害人类健康。皮下注射异丙肾上腺素会导致大鼠急性心肌缺血，这种损伤与人体急性心肌缺血类似[1-3]。心肌缺血损伤时大量释放的三磷酸腺苷（ATP）可引起心绞痛等症状[4]。P2X3为ATP主要受体，二者在痛觉信号传递及处理过程中有着重要作用[5-7]。但P2X3受体表达与心肌缺血损伤程度的相关性尚未见报道。为此本研究运用Powerlab记录心肌缺血大鼠心电图的变化，并观察同一病程心肌组织中P2X3受体mRNA的表达，进而探究P2X3在急性心肌缺血损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠100只，体重（250±30）g，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2012-0001。实验过程中对动物的处置符合国家颁布的有关善待实验动物的指导性意见要求。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂 异丙肾上腺素（ISO）（美国Sigma公司），Trizol Reagent（美国 invitrogen公司），SYBR premix ExTaq TM（日本 TakaRa公司），Prime－Script逆转录试剂盒（日本TakaRa公司）。

1.2.2 主要仪器 Power Lab l 6/30生理记录仪、Power Lab Chart软件（Version 7）（澳大利亚 AD Instruments公司），407型小动物呼吸系统（深圳瑞沃德公司），NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），ALLEGRA 64R型台式高速冷冻离心机（美国Beckman公司），7500 Fast Real-Time PCR System（美国 Applied Biosystems公司），梯度荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.3 分组及模型制作 大鼠随机分为心肌缺血损伤组50只和生理盐水对照组50只。心肌缺血损伤组按每天60 mg/kg的剂量（40 mg/ml溶于生理盐水中）于背部皮下多部位注射异丙肾上腺素，连续注射2 d，间隔24 h。心肌缺血损伤组以病程第1、2、3、4、5天再分成5组，每组10只。病程第一天是两次注射ISO后4 h。生理盐水对照组除注射等量生理盐水外，余操作同心肌缺血损伤组。

1.4 心电图监测 将SD大鼠仰卧位固定连接于动物呼吸机上；于大鼠左、右前肢及右后肢肌肉插入针形电极作为心电信号的电极引导，开启Power Lab l6/30生理记录仪，记录标准Ⅱ导联心电图。

1.5 RNA的提取和质量检测 各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后断颈处死，即刻摘取心脏，并予生理盐水冲洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鲜冻存心脏组织，将左心室剪成所需大小组织，采用Trizol提取组织RNA，NanoDrop 2000分光光度计检测RNA纯度和浓度。

1.6 实时荧光定量PCR 每个样本分别取2 μg总RNA进行逆转录后存于-80℃冰箱。P2X3的上游引物序列为 5′-ACA GCA TCC GTT TCC CTC TC-3′，下游为 5′-ACC ACA TCC CCT ACC CTC AA-3′，引物长度136 bp；内参GAPDH上游引物序列为 5′-GCC TGG AGA AAC CTG CCA A-3′，下游为 5′-CAT TGA GAG CAA TGC CAG CC-3′，引物长度171 bp；荧光定量PCR反应体系:SYBR premix ExTaq TM 10 μl，primer-F：0.4 μl，primer-R：0.4 μl，ROX Ⅱ :0.4 μl，ddH2O 6.8 μl，cDNA 2 μl，20 μl体系。反应条件：①预变性 95℃ 30 s；② 变性，95℃ 5 s；③退火，延伸，60℃ 30 s。40个循环。采用ABI 7500 Real time PCR仪检测各样本中mRNA的表达情况。实验采用2-ΔΔCt值表示 P2X3的相对表达量。在相对定量分析中，Real-Time PCR结果以Ct值表示。每个标本重复3次，Ct值取平均值；以GAPDH作为内参照，ΔCt值=P2X3基因Ct值－GAPDH基因Ct值；以生理盐水组为对照，ΔΔCt值=心肌缺血损伤组心肌P2X3的ΔCt值－生理盐水对照组心肌P2X3的ΔCt值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，行t检验。

2 结果

2.1 不同病程对应时间段生理盐水对照组心电ST段振幅与P2X3受体mRNA表达 在不同病程阶段，生理盐水对照组心电图S-T段的抬高幅度很小，只轻微地上下偏移，与正常状态下大鼠心电图一致。此时，以GAPDH作为内参照，对应的P2X3受体mRNA表达ΔCt值也几乎相同。由此可见，正常状态下不同时间段内，P2X3受体mRNA表达几乎相同。见表1。

2.2 不同病程心肌缺血损伤组心电S-T段振幅变化与P2X3受体mRNA表达 病程第2天，S-T段振幅抬高＞0.1 mV，ISO皮下注射造模成功，大鼠心肌P2X3受体mRNA表达较生理盐水对照组显著上升，且差异具有统计学意义。病程第3天，S-T段抬高幅度达最高值，同一病程心肌P2X3受体mRNA表达量亦达最高值。病程第4天，大鼠心肌缺血有所恢复，S-T段抬高幅度开始下降，同一病程心肌P2X3受体mRNA表达量较前一日亦开始下降。纵观整体病程发现，大鼠心肌P2X3受体mRNA的表达与心电图S-T段抬高幅度具有相关性，随S-T段抬高幅度增大而增加，随S-T段抬高幅度减小而减少。见表2。

表1 生理盐水对照组P2X3受体mRNA表达与心电 S-T 段振幅（±s）

表1 生理盐水对照组P2X3受体mRNA表达与心电 S-T 段振幅（±s）

时间 S-T段抬高（mV） ΔCt值对照病程第 1 天 -0.014±0.040 17.670±1.301对照病程第 2 天 0.012±0.038 17.760±0.524对照病程第 3 天 0.005±0.035 17.830±0.921对照病程第 4 天 0.031±0.049 17.490±1.208对照病程第 5 天 0.020±0.037 17.100±0.853

表2 心肌缺血损伤组P2X3受体mRNA表达与心电 S-T 段振幅（±s）

表2 心肌缺血损伤组P2X3受体mRNA表达与心电 S-T 段振幅（±s）

时间 S-T段抬高（mV） 2-ΔΔCt值病程第 1 天 0.079±0.068 1.503±0.300病程第 2 天 0.255±0.102 6.022±1.125病程第 3 天 0.259±0.106 4.206±0.642病程第 4 天 0.208±0.074 3.693±0.553病程第 5天 0.161±0.063 2.012±0.283

3 讨论

心电图检测具有简便无创等优点，应用于心肌缺血的诊断具有一定的临床意义。生理状态时，心电图波形中S-T段大致同等电位线相平行，或略上下偏移。本研究结果显示，生理盐水对照组的心电图波形与上述生理状态时波形状态一致。而在心肌缺血时，心电图波形中的S-T段会抬高[8,9]。本研究结果显示，模型组心电图波形中S-T段抬高，幅度＞0.1 mV，表明皮下注射ISO模型制备成功，与以往的研究结果类似。

大鼠的心肌缺血为渐进式损伤。张云等[2]的研究表明，大鼠皮下注射60 mg/kg ISO及以下剂量的方法多用于急性心肌缺血的诱导，且损伤是可逆的。本研究结果显示，在心肌缺血病程第1、2、3天，心电图波形中S-T段随病程进展而逐渐抬高，第4、5天后，心电图波形中S-T段逐渐下降，表明模型大鼠心电图波形随着病程的延长而逐渐自我恢复，与以往可逆性损伤的研究结果相一致。

研究表明，大鼠皮下注射ISO后会引起心肌组织缺血，进而破坏心肌细胞膜并产生ATP。众所周知，ATP为细胞内能量物质，可作用于细胞表面嘌呤受体进而产生信号传导。ATP的主要受体为P2X3，二者相互结合，大量表达于伤害性感觉神经元中，参与疼痛信号转导。本实验结果显示，在病程第2天，心电图波形S-T段抬高＞0.1 mV，模型大鼠心肌组织P2X3中mRNA含量较生理盐水对照组明显增高，且差异具有统计学意义。在病程第3天，心电图波形S-T段抬高至最高峰，模型大鼠心肌组织P2X3中mRNA含量亦达到最高值。病程第4天，心电图波形S-T段开始下降，模型大鼠心肌组织P2X3中mRNA含量较前一日降低。病程进展至第5天，心电图波形中S-T段与P2X3中mRNA较前一日皆进一步下降。上述研究结果表明，心电图波形S-T段与P2X3受体具有明显的相关性，即心肌P2X3受体表达量随着心肌缺血病情进展而增加；反之，随着心肌缺血病情恢复，心肌P2X3受体表达量亦相应减少。该现象提示，在心肌缺血时P2X3受体敏感性显著增强，并参与了心肌缺血的病理过程。这可能是由于心肌缺血时，心肌细胞中ATP将P2X3受体激活后二者共同参与心肌缺血所引起的心绞痛等一类伤害性信息传递。

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Corresponding changes of electrocardiogram and myocardial P2X3 receptor mRNA expression in rats with different stages of myocardial ischemia injury

DONG Ya-qin，HUANG Qian-ru，SA Zhe-yan，et al.Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350003，China

XU Jin-sen，E-mail：xujinsenjls@163.com

ObjectiveTo observe the corresponding changes of ECG and myocardial P2X3 receptor mRNA expression in rats with different stages of myocardial ischemia injury induced by isoproterenol（ISO）.MethodsThe rat model of myocardial ischemia injury was established by subcutaneous injection of 60 mg/kg ISO（2 consecutive times,each time Interval of 24 h），and the expression of ECG S-T segment and myocardial P2X3 receptor mRNA was observed by ECG and QPCR detection method in each stage of myocardial ischemia injury in every 10 rats after finishing the inject ISO of the same day（Stage 1），the second day（Stage 2），the third day（Stage 3），the fourth day（Stage 4）and the fifth day（Stage 5）.ResultsThe ECG S-T segment of different stages of myocardial ischemia injury and the expression of myocardial P2X3 receptor mRNA all increased at first and then decreased which showed some correspondence with significant difference.ConclusionThe expression of myocardial P2X3 receptor mRNA in different stages of myocardial ischemia injury and the amplitude of the ECG S-T segment is obviously correlated.The sensitivity of P2X3 receptor is significantly enhanced during myocardial ischemia and participated in the pathological process of myocardial ischemia.

Myocardial ischemia； Electrocardiogram； Isoproterenol； P2X3 receptor

国家自然科学基金项目（项目编号：81403490，81573886）；福建省科技厅省属公益类项目（项目编号：2015R1035-3）；福建省教育厅中青年教师教育科研B类项目（项目编号：JB14050）；福建省经络感传重点实验室资助

350003 福建省福州市，福建省中医药研究院

许金森，E-mail：xujinsenjls@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.12.023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）12-1137-03

2017-04-27）