刘扬，卢斌，赵红卫

(三峡大学第一临床医学院·宜昌市中心人民医院，湖北宜昌 443000)

半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇对急性脊髓损伤的保护作用及机制

刘扬，卢斌，赵红卫

(三峡大学第一临床医学院·宜昌市中心人民医院，湖北宜昌 443000)

目的探讨半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇对急性脊髓损伤的保护作用及机制。方法60只无特殊病原菌的雄性SD大鼠，随机均分为A、B、C、D、E组。通过Allen′s法打击进行脊髓造模。A组腹腔注射半乳糖凝集素-1 4 mg/kg联合雷公藤内酯醇0.4 mg/kg，1次/d,持续1周；B组腹腔注射半乳糖凝集素-1 4 mg/kg，1次/d，持续1周；C组腹腔注射雷公藤内酯醇0.4 mg/kg，1次/d,持续1周；D组腹腔注射甲基强的松龙30 mg/kg,12 h后再重复1次，以后1次/d，重复3 d；E组腹腔注射生理盐水3 mg/kg，1次/d，持续1周。分别于术后1、3、7、14 d对各组大鼠进行行为学评价(BBB评分+斜板倾斜度)；于术后14 d行病变脊髓组织苏木精-伊红染色法及免疫组化染色检查，同时用ELISA法测定IL-10及TNF-α表达水平。结果术后7、14 d，A组BBB评分及斜板倾斜度较其余组高(P均<0.05)；其中B、C、D组间比较，P均>0.05。术后14 d的HE染色结果显示A组的脊髓组织神经元数量多于其余组(P均<0.05)。免疫组化染色结果提示，A组脊髓组织的GAP-43阳性表达水平较其余组高(P均<0.05)。术后7 d及14 d ，与其余组比较，A组TNF-α表达水平低，IL-10水平高(P均<0.05)，而B、C、D组间比较，P均>0.05。结论半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇可减轻急性脊髓损伤的进一步损害，其作用机制可能与上调IL-10及下调TNF-α的表达水平有关 。

急性脊髓损伤；半乳糖凝集素-1；雷公藤内酯醇；甲基强的松龙；大鼠

急性脊髓损伤(ASCI)的治疗，除及时有效地行脊髓减压手术外，药物亦是ASCI治疗与康复过程中的又一重要举措。治疗ASCI的经典药物甲强龙(MP)及神经节苷脂临床疗效被提出质疑，已经不再作为治疗ASCI的指南性用药[1]，仅作为治疗的选择。目前学者普遍认为，药物联合疗法在神经修复过程中具有重要意义[2]。研究表明，半乳糖凝集素-1具有促进神经生长、调节免疫、抗炎、抗细胞凋亡及促进血管生成等作用[3]。雷公藤内酯醇主要用于治疗多种自身免疫性疾病，具有抗感染、免疫抑制等多种生物学活性[4]；另外，其对炎症亦有直接的抑制作用，理论上可减轻ASCI中的继发性损伤。目前上述两种药物联合治疗ASCI的研究未见报道，2017年6～8月，本文初步探讨了半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇在大鼠ASCI中的保护作用，为临床应用治疗ASCI提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠：三峡大学动物实验中心提供，质量250～300 g，符合国家医用动物的使用标准；半乳糖凝集素-1蛋白：上海超研生物科技有限公司；雷公藤内酯醇：大连辉瑞；TNF-α及IL-10的ELISA试剂盒均来自上海博谷生物科技有限公司；Allen′s打击架：自行制备；切片机：德国MICROM公司；脱水机：德国Leica公司；包埋机：德国莱卡公司；显微镜及图像分析系统：德国莱卡公司；多功能荧光酶标仪：瑞士TECAN公司；MP、生理盐水、其他试剂及仪器均由宜昌市中心人民医院中心实验室提供。

1.2 SD大鼠ASCI模型建立及分组 60只无特殊病原菌的SD大鼠，全部称重后随机均分为A、B、C、D、E组，各12只。大鼠麻醉：用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g腹腔注射后，通过摸肋骨的方法确定T10，逐层切开皮肤、筋膜、肌肉达T10棘突，小心咬除T10棘突及椎板后，依照Allen′s法[3]撞击脊髓造模(重15 g的砝码从10 cm处垂直落下撞击垫片，当大鼠尾巴出现痉挛摆动或躯体出现回缩抽动后, 则提示造模成功)。造模成功后立即给药，各组大鼠给药方式均采用腹腔注射，A组：给予半乳糖凝集素-1 4 mg/kg及雷公藤内酯醇 0.4 mg/kg，1次/d，持续1周；B组：给予半乳糖凝集素-1 4 mg/kg，1次/d，持续1周；C组：给予雷公藤内酯醇 0.4 mg/kg，1次/d，持续1周；D组：给予MP 30 mg/kg，12 h后再重复1次，以后1次/d，维持3 d；E组：给予生理盐水3 mL/kg，1次/d，持续1周。术后应用常规剂量抗生素预防感染，连续3 d；且下腹部按压膀胱刺激大鼠排尿，3次/d，直至大鼠恢复自主排尿功能。

1.3 ASCI大鼠行为学评价 每组分别于术后1、3、7、14 d各取6只大鼠来评估大鼠脊髓损伤后的神经恢复情况。BBB评分[5]：把SD大鼠平放在操作台上，观察并记录其后肢的运动情况，为了减少误差，评分者为熟知BBB评分标准的非实验人员；斜板试验：将术后SD大鼠置于一块有纹理的斜板上，使大鼠身体轴线与斜板纵轴保持一致，逐渐缓慢地抬高斜板一端，观察并记录大鼠停留在斜板上5 s时的最大倾斜角度，测量3次后取其均值。

1.4 ASCI大鼠的脊髓组织病理学变化观察 采用HE染色及免疫组化染色。术后14 d神经功能评定后进行麻醉，然后暴露心脏，左心室插管作为灌入道，剪开右心耳为其流出道，通过输液器灌注温生理盐水500 mL，直至大鼠肝脏变白；然后用同样的方法再灌注4%多聚甲醛溶液固定，待大鼠出现四肢抽搐、肢体变硬后更换体位，进行逐层暴露损伤处脊髓组织，取1 cm标本置于固定液中固定过夜，梯度脱水，石蜡包埋后4 μm切片,每个标本切6张，分别进行HE染色及GAP-43免疫组化染色，最后在400倍光学显微镜下观察脊髓神经组织形态学改变情况。

1.5 SCI大鼠血清中IL-10及TNF-α水平比较 各时间点取SD大鼠尾静脉取血，进行IL-10及TNF-α表达检测，操作步骤严格按照ELLSA说明书，加入相应酶标试剂、显示剂和终止液后测量各孔的光密度值并记录。

2 结果

2.1 各组BBB评分及斜板倾斜度比较 术后7、14 d ，A组的BBB评分及斜板倾斜度较其余组高(P均<0.05)，而B、C、D组组间比较，P均>0.05。 详见表1、2。

表1 各组术后各时点BBB评分比较(分，

注：与 A组同时点比较，*P<0.05。

表2 各组术后各时间点斜板倾斜度比较

注：与 A组同时点比较，*P<0.05。

2.2 各组神经元细胞数及GAP-43阳性表达比较 术后14 d，各组损伤部位神经元出现胶质瘢痕形成，胞质细胞大量增生，大量的神经元细胞数量减少，但是存活的神经元包膜仍清晰可见。其中B、C、D组间病理表现无差异。术后14 d，神经元细胞数：A、B、C、D、E组分别为(186±46)、(82±25)、(86±21)、(100±32)、(60±15)个/HP。A组神经元数量多于其余各组(P均<0.05)，且A组组织结构较其他组清晰。术后14 d ，GAP-43阳性表达的积累光密度值(IOD值)： A、B、C、D、E组分别为120±18、89±24、80±15、85±19、72±13。A组GAP-43阳性表达的IOD值高于其余组(P均<0.05)；B、C、D组间比较，P均>0.05。

2.3 各组术后各时点血清中IL-10、TNF-α水平比较 见表3、4。

表3 各组术后各时点血清IL-10水平比较

注：与A组同时点比较，*P<0.05。

3 讨论

ASCI后所致的神经损伤包括原发性损伤和继发性损伤，前者在受伤的当时就已经决定且不可逆转；而继发性损伤发生在原发性损伤之后，是由缺血、水肿、氧化应激、炎症反应及神经元坏死等多种机制所介导的可进一步损害受损的脊髓神经组织[6]，因此临床上采用药物联合多阶段多方位地改善脊髓神经组织的微环境，为修复ASCI创造更多有利条件。研究发现，内源性的半乳糖凝集素-1是由神经元细胞和星形胶质细胞分泌，特别是星形胶质细胞[7]。该蛋白在机体内有多种存在形式，其中二聚体为该药物的活性状态，但其最终存在的形态取决于它的相对浓度和中枢神经系统内不同组织的生化特征[8]。实验表明，氧化态的半乳糖凝集素-1主要作用在于促进周围神经的突触生长及轴突再生[9]。有文献报道，半乳糖凝集素-1在ASCI中可能是通过吞噬作用、调节炎症反应、促进神经胶质增生及轴突再生等发挥保护作用[10]。亦有文献报道，在脊髓损伤动物模型中发现，中性粒细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和星形胶质细胞瞬时表达半乳糖凝集素-1[11]。这些论据间接阐述了半乳糖凝集素-1在脊髓损伤修复中扮演着重要角色。雷公藤内酯醇是从雷公藤属植物中提纯得到的一种单体，目前临床上主要用于治疗急慢性肾小球肾炎、狼疮性肾炎、类风湿性关节炎等疾患。其主要是通过降低血管通透性、抑制炎症细胞的趋化及产生、减轻血小板的聚集及炎症后纤维增生等作用来发挥其临床疗效。该药物在脊髓损伤中的研究较少，已有大量的研究证实了雷公藤内酯醇可以抑制IFN-γ、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6[12]等因子，且能上调抑炎因子IL-10、TGF-β、IFN-β等表达[13]，理论上可以调控脊髓损伤后的微环境，促进脊髓损伤的恢复。据此推测半乳糖凝集素-1和雷公藤内酯醇联合使用治疗ASCI具有协同作用，因此本实验的宗旨是建立可靠的大鼠ASCI模型，观察ASCI后半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇对大鼠的保护作用。

表4 各组术后各时点血清TNF-α水平比较

注：与A组同时点比较，*P<0.05。

BBB评分随病情好转表现为逐渐升高的趋势，可以较好地反映ASCI恢复的全过程，且符合其损伤的程度；斜板试验用于辨别神经功能的损伤程度，操作简单且重复性好。本实验结果表明，随着术后时间的不断延长，各组大鼠的后肢运动功能均有所改善，术后7 d及14 d，A组大鼠的BBB评分高于其他组，而其余3个药物组间差异无统计学意义；表明半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇对SD大鼠SCI后的脊髓神经功能具有保护作用，且疗效优于单独使用及MP。

在ASCI发病过程中，错综复杂的免疫炎症反应常会加重脊髓损伤，导致脊髓组织进一步坏死，以及尚存的一些神经细胞逐渐崩解促使损伤范围逐渐加大。脊髓组织HE检查显示，伤后14 d，A组脊髓组织神经细胞数多于其余各组，亦可观察到A组大鼠脊髓神经结构较其余3个药物组清晰，这表明半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇可以减轻ASCI后脊髓神经的损害，在组织病理学上优于其他各药物组。

中枢神经系统中富含星形胶质细胞，该细胞参与全身多种病理生理反应。研究表明：它一方面限制了炎症反应；另一方面，它通过分泌硫酸软骨素及蛋白多糖防止轴突细胞的再生，星形胶质细胞增多有利于脊髓神经损伤的修复[14]。本研究中，A组的星形胶质细胞(GAP-43阳性表达)数高于其他药物组。表明A组的脊髓神经存活及再生多于其他各药物组，提示半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇对ASCI后的大鼠脊髓神经功能恢复有促进作用。

IL-10是机体抑制炎症反应的细胞因子之一，国内外已有大量文献指明该因子的高表达有利于ASCI后神经功能的恢复[15]。本研究结果显示，术后7 d及14 d，A组IL-10表达水平高于其余组，说明药物联合抑制炎症反应的效果较单独使用及MP好。进一步表明半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇可能是通过增强IL-10的表达，从而发挥脊髓神经的保护作用。TNF-α为体内多种生物活性的促炎因子和创伤后反应的重要介质之一，它可以在脊髓损伤局部部位迅速合成，在局部炎症放大中具有重要意义。本研究结果表明，术后7 d及14 d，A组TNF-α表达水平低于其余组。提示半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇治疗ASCI的作用机制之一可能是通过下调促炎因子TNF-α的表达水平。

综上所述，半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇可减轻ASCI后继发性损害，且其疗效优于单独使用半乳糖凝集素-1或雷公藤内酯醇。其作用机制可能是通过上调IL-10以及下调TNF-α表达水平来发挥脊髓神经保护作用的，本研究为半乳糖凝集素-1联合雷公藤内酯醇治疗ASCI奠定了一定的理论基础，拟为临床治疗ASCI提供一种新的思路。

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