张彦君，魏 晋，周鑫辉，雍洪亮，李 鹏，马颢荣，布同良，唐自钟，陈 惠

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）

响应面法优化产内切葡聚糖酶重组大肠杆菌发酵培养基

张彦君，魏 晋，周鑫辉，雍洪亮，李 鹏，马颢荣，布同良*，唐自钟，陈 惠

（四川农业大学生命科学学院，四川雅安 625014）

【目的】对产内切葡聚糖酶重组大肠杆菌的发酵培养基进行优化。【方法】采用单因素实验和响应面Box-Behnken实验设计相结合，对培养基的碳源及浓度、氮源及浓度和无机盐离子及浓度进行优化。【结果】结果表明，最佳的碳源、氮源和无机盐离子及添加量分别为乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化镁0.11%，发酵产酶酶活最大值达到191.23 U/mL，比优化前52.43 U/mL提高了3.65倍。【结论】利用响应面法Box-Behnken实验设计对产内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌K369R进行培养基发酵条件优化，为内切葡聚糖酶在工业中的大规模生产提供理论依据。

重组大肠杆菌；内切葡聚糖酶；响应面法；培养基优化

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，在自然界中分布广泛，是取之不尽、用之不竭的天然高分子化合物[1]。由于其丰富性和特殊的性能，使纤维素成为石油最有潜力的替代品[2]。尽管植物来源的纤维素具有实现这目标的潜力，但由于将植物纤维素转化为生物醇衍生物和生物柴油时存在困难，目前大规模应用是有问题的[3]。目前纤维素的降解方式主要有酸降解、碱降解、热降解、氧化降解和微生物降解等。利用微生物降解纤维素，可以有效提高其综合利用率，因而成为近年来研究的热点[4-5]。

纤维素降解过程中需要3种酶，即内切葡聚糖酶（endoglucanase，EG）、外切葡聚糖酶（cellubiohydr alases，CBH）和 β-葡聚糖苷酶（β-glucosidases，BG）的协同作用将纤维素降解为葡萄糖。天然纤维素酶催化活性低、生产成本高，很难符合工业生产的需求[6]。通过基因工程、蛋白质工程及发酵工程的手段可以对相关基因进行有效改造，优化产酶发酵培养基，进而提高相关酶的活性及产酶效率。前期，本研究室利用定点突变技术对内切葡聚糖酶F-10基因进行改造并获得重组大肠杆菌K369R，其比活力及热稳定性较原始酶有明显改观，酶活性方面改变不明显[7]。研究表明，通过发酵条件的优化可以有效提高工程菌产酶能力。杨晓志等[8]研究通过对大肠杆菌工程菌K12△dapA发酵条件优化，产L-苏氨酸提高了近1.2倍。王华等[9]在原有培养基基础上选用不同的碳源、氮源、金属离子及磷酸盐对重组大肠杆菌PUCRF产β-CGTase能力进行比较，经优化β-CGTase酶活力提高1.34倍。张龙等[10]采用响应面分析方法对重组大肠杆菌生产精氨酸脱亚胺酶（ADI）的发酵培养基进行了优化，优化后比初始培养基提高了1.53倍，比LB培养基提高了2.01倍。响应面法可以有效优化发酵产酶条件。本研究以前期构建的重组大肠杆菌K369R为研究对象，在单因素基础上，运用响应面法对其发酵培养基进行优化，旨在进一步提高重组大肠杆菌（K369R）产内切葡聚糖酶的能力，为该酶的工业化生产提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 菌株

试验菌株来自四川农业大学生命科学学院生物化学与分子生物学实验室构建并保存的重组大肠杆菌K369R。

1.2 实验试剂

异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氨苄青霉素（Amp）均购自北京索莱宝科技有限公司，其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.3 培养基

LB+Amp培养基：在LB培养基基础上加入Amp使其终浓度为100 μg/mL。

基础发酵培养基（100 mL）：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，pH自然。

IPTG（24 mg/mL）和 Amp（100 mg/mL）参照李雨霏[7]的方法配置。

1.4 菌株的活化与发酵

将活化后的菌株由LB固体培养基接到液体培养基，于37℃180 r/min摇床震荡培养过夜，以2%的接种量接于发酵培养基在37℃、180 r/min摇床培养至OD600达0.4～0.8。分别向各培养基中加入诱导剂IPTG至终浓度为1 mmol/L，在37℃、200 r/min培养5 h。

1.5 发酵粗酶液的制备

实验选用超声波法进行大肠杆菌细胞的破碎。具体方法参照李雨霏[7]的方法。

1.6 内切葡聚糖酶活力的测定

内切葡聚糖酶活力测定根据姚友旭[11]的方法略加改进。酶活力的定义：在1.4节所述培养条件下，1 mL酶液每分钟催化底物产生相当于1 μg葡萄糖所需的酶量即为一个酶活力单位（U/mL）。

1.7 单因素实验

1.7.1 碳源及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

根据史永磊的方法[12]稍做改变。以1.0%的蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、麦芽糖和甘油为发酵培养基的碳源，以0.5%的蛋白胨为发酵培养基的氮源，测定酶活力，确定最佳碳源。在最佳碳源的基础上，选择0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳碳源的添加量为培养基的碳源，确定最佳碳源浓度。

1.7.2 氮源及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

在最佳碳源及浓度的基础上，选择0.5%的蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵为培养基的氮源，测定酶活力，确定最佳氮源浓度。选择0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和1.2%的最佳氮源作为培养基的氮源，确定最佳氮源浓度[10]。

1.7.3 无机盐离子及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

在最佳碳源、氮源及浓度的基础上，选择0.1%的氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁和氯化锰添加到发酵培养基中，测定酶活力，确定促进效果最佳的离子。选择0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%和0.25%的最佳离子添加到发酵培养基中，确定最佳的离子浓度。

1.8 响应面BOX-Behnken试验设计

通过对单因素的实验结果的整理与分析，进行响应面分析。采用Design expert 8.0.6软件程序数据处理，结合Box-Behnken中心组合试验设计的原理，选取自变量因素分别为乳糖（A），酵母粉（B）及氯化镁（C）3个因素，响应值设计为内切葡聚糖酶的酶活力（R1），运用响应曲面回归分析（Response surface analysis，RSA）对重组大肠杆菌发酵培养基进行优化[13-15]。Box-Behnken试验设计因素水平各不同（见表1）。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平Table1 Factors levels in response surface design

2 结果与分析

2.1 碳源及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

纤维素酶是诱导酶，不同的碳源对产酶的影响各不相同[16]。由图1a可知，重组大肠杆菌K369R在以乳糖为碳源时，内切葡聚糖酶酶活力最高达70.97 U/mL；最低的为葡萄糖，仅为33.20 U/mL。选择乳糖为下一步试验的碳源。由图1b可知，乳糖的浓度对内切葡聚糖酶酶活力的影响趋势为先升高再降低，然后再升高。在乳糖为0.6%的添加量时，酶活力达到最大值，为84.65 U/mL。而在添加量为1.2%时，酶活力又呈上升趋势，达75.36 U/mL。两者酶活力相差不多，从经济的角度考虑，选择0.6%乳糖继续下一步试验。

2.3 氮源及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

重组大肠杆菌K369R既可以利用有机氮源也可以利用无机氮源。由图2a可知，重组大肠杆菌K369R对有机氮源的利用效率明显高于无机氮源，其中内切葡聚糖酶酶活力最高的为酵母粉，酶活高达94.74 U/mL。当使用无机氮源时，酶活力较低，最低的为硝酸铵，仅为23.45 U/mL。选择酵母粉作为氮源进行下一步的试验。由图2b可知，在添加量小于1.0%时，随着浓度的升高酶活力增加，在1.0%时达到最高值，为106.53 U/mL；而超过1.0%，浓度增加，酶活力降低。选择1.0%酵母粉进行下一步的试验。

图1 不同碳源及浓度对内切葡聚糖酶酶活力的影响Figure1 Effect of carbon source and concentration on endoglucanase activity

图2 不同氮源及浓度对内切葡聚糖酶酶活力的影响Figure2 Effect of nitrogen source and concentration on endoglucanase activity

2.5 无机盐离子及浓度对重组大肠杆菌K369R产酶的影响

由图3a可知，氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁对内切葡聚糖酶都有促进作用，且氯化镁的效果最好，达118.43 U/mL。而氯化锰有抑制作用。可能是因为Mg2+是许多酶的辅助因子，并参与微生物细胞壁的形成，对产酶具有重要作用。选择氯化镁进行下一步试验的。由图3b可知，Mg2+的浓度对内切葡聚糖酶的影响趋势是先升高在降低，最后在升高的趋势，在浓度为0.10%时产酶活力到达峰值，为187.00 U/mL，选择0.10%的氯化镁进行下一步试验。

图3 无机盐离子及浓度对内切葡聚糖酶酶活力的影响Figure3 Effect of inorganic salt and concentration on endoglucanase activity

2.7 响应面Box-Behnken试验设计优化结果分析

对培养基成分进行响应面分析，结果如表2所示。利用Design Expert 8.0软件对数据进行多元二次回归拟合，获得多元二次方程：R1=188.29+6.21A+9.44B+7.53C-1.25AB-11.79AC+0.42BC-13.65A2-14.89B2-16.81C2，其中R1是预测的内切葡聚糖酶酶活力，A是乳糖浓度，B是酵母粉浓度，C是氯化镁浓度。

表2 响应面试验设计分析Table2 Response surface design and corresponding analysis

表3 方差分析Table3 ANOVA of regression analysis

对二次回归方程进行方差分析结果（见表3）。本试验所得拟合二次回归方程响应面分析模型P值具有显著性（见表3），R2=0.9686。表明试验的因变量与自变量之间存在多元回归性，且因素间多元回归关系具有显著性。试验实际值与预测值之间相关性表明该实验方法具有极高的可靠性，并且也证明该回归方程具有模拟真实曲面的真实性。从F值的大小可以推断得出，试验选取三因素对内切葡聚糖酶酶活力的影响排序为酵母粉＞氯化镁＞乳糖。

为求得每个条件的最佳值，对所得的回归方程求一阶偏导，得到 A=0.135，B=0.315，C=0.180，对应的培养基配制实际值：乳糖0.63%，酵母粉1.06%，氯化镁0.11%，对应的响应值R1最大预测值为190.872U/mL。利用Design-expert软件对数据分析，可以得到响应面图和等值线图，3个因素之间的交互作用见图4，从以下等值线图和三维分析图可见，响应面的稳定点在所实验的区域内。在响应面等高线分析中，椭圆形或者马鞍形的等高线被认为是参数之间交互作用显著，而圆形则被认为是不显著[17]。由图4a可知，当氯化镁的添加量为0.10%时，在一定范围内，内切葡聚糖酶酶活力随着乳糖和酵母粉的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和1.06%的酵母粉的添加量时，酶活达到最高值。等高线为近椭形，说明两者的交互作用较为显著。由图4b可知，当酵母粉的添加量为1.0%时，在一定范围内，内切葡聚糖酶酶活力随着乳糖和氯化镁的添加量的增加而增加，在0.63%的乳糖和0.11%的氯化镁的添加量时，酶活达到最高值。等高线为椭圆形，说明两者的交互作用较强。图4c可知，在一定范围内，内切葡聚糖酶酶活力随着酵母粉和氯化镁的添加量的增加而增加，在1.06%的酵母粉和0.11%的氯化镁的添加量时，酶活达到最高值。等高线为扁圆形，说明两者的交互作用不显著。

图4 各因素的响应面图及等高图Figure4 Response surface and contour plots of protease production

为了验证这个模型的准确性和实用性，用响应面优化后的培养条件进行了验证试验。做3次重复试验，所得的内切葡聚糖酶酶活力分别为191.23 U/mL、189.75 U/mL和190.68 U/mL，与预测值190.872 U/mL想接近，可以说明该模型具有实际意义。

3 讨论

3.1 碳源的选择

碳源为微生物的生长提供物质基础和能量来源。选择乳糖为最佳碳源可能是其一方面作为基础营养物质，为微生物的生长繁殖提供能量、为蛋白质等的合成提供碳骨架，另一方面又可以作为有效的诱导剂诱导重组蛋白的表达[18]。葡萄糖作为碳源时酶活力较低，可能是产生了“葡萄糖效应”，即以葡萄糖作为碳源虽能促进菌体生长，但对产酶相关基因的表达有阻遏作用，必须在这些物质被耗尽后才开始相关纤维素酶的合成[19]。

3.2 氮源的选择

氮源是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，对微生物的生长发育有重要的作用。酶本身是蛋白质，而氮元素是构成蛋白质的主要元素，因此氮源添加量对于产酶有重要作用[20]。达到一定浓度后，酶活力降低可能是由于添加量过高，会导致溶液变得更加黏稠，从而使底物流动性下降，不利于菌株生长及产酶。

3.3 响应面分析

目前，用于优化发酵条件的数学统计方法有很多，比如正交实验法和响应面分析。响应面分析比正交实验法更为有效，因为响应面法是利用合理的试验设计方法并通过试验得到一定数据[21]，采用多元二次回归方程拟合多个因素与响应值之间的函数关系，通过分析回归方程寻求最优工艺参数，解决多变量问题的统计方法[22]，在化学工业、生物学、医学以及食品学等领域得到广泛的应用。

舒畅等对重组大肠杆菌产谷氨酰胺转移酶的发酵条件进行优化，在运用响应面法优化后提高了1.56倍[23]。和玉军等对重组大肠杆菌产脂肪氧合酶发酵条件优化，利用响应面Box-Behnken设计进行优化，优化后比优化前提高了56.87%[24]。Chen等运用响应面法对双歧杆菌和干酪乳杆菌的山羊奶发酵条件优化，最佳发酵条件对山羊奶发酵制品的响应值有正面影响[25]。Jia R.B.等通过单因素和响应面方法中的复合设计对Monacus菌株M-3产TMP的培养基及也太发酵组成进行优化，TMP的产量最高可达 13.49 μg/mL[26]。

4 结论

通过单因素实验和响应面Box-Behnken试验设计对产内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌K369R进行培养基发酵条件进行优化，得到最佳培养基发酵条件为乳糖0.63%、酵母粉1.06%和氯化镁0.11%，预测蛋白酶最大酶活为190.872 U/mL，实测最大值达到191.23 U/mL，比优化前52.43 U/mL提高了3.65倍。

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Optimization of Culture Medium of Recombinant Escherichia Coli for Endoglucanase Production by Response Surface Methodology

ZHANG Yan-jun，WEI Jin，ZHOU Xin-hui，YONG Hong-liang，LI Peng，MA Hao-rong，BU Tong-liang*，TANG Zi-zhong，CHEN Hui
（ College of Life Science，Science Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China)

【Objective】The study aimed to optimize the fermentation medium of recombinant E.coli for endoglucanase production.【Method】Single factor experiment and response surface Box-Behnken design were used to optimize the carbon source and concentration，nitrogen source and concentration of the medium，and the concentration of inorganic salt.【Results】The results showed that the best carbon source，nitrogen source and inorganic salt ion were lactose，yeast powder and magnesium chloride respectively.The addition amount of various factor in fermentation medium was 0.63%lactose，1.06%yeast powder，0.11%magnesium chloride.Under the optimized conditions，the maximum endoglucanase activity reached to 191.23 U/mL，which was 3.65 times higher than that before optimization of 52.43 U/mL.【Conclusion】The fermentation conditions of recombinant Escherichia coli K369R were studied by using the response surface method Box-Behnken experiment.This research can provide the basis for the theoretical endoglucanase large-scale manufacture.

recombinant E.Coli；endoglucanase；response surface methodology；medium optimization

Q71

A

1000-2650（2017）04-0581-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.019

2017-05-05

四川省教育厅项目（13ZB0276）；四川农业大学科研兴趣培养计划项目。

张彦君，在读硕士。*责任作者：布同良，博士，讲师，主要从事微生物与生物质资源开发利用，E-mail：tlbu@163.com。

（本文审稿：陈 强；责任编辑：秦碧雯；英文编辑：刘益平）