倪知游，夏 惠 ，2，高 帆 ，刘 继，胡容平 ，梁 东，2*

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.四川农业大学果蔬研究所，成都 611130；3.成都市农林科学院，成都 611130；4.四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066）

外源褪黑素对猕猴桃幼苗盐胁迫的缓解作用

倪知游1，夏 惠1，2，高 帆1，刘 继3，胡容平4，梁 东1，2*

（1.四川农业大学园艺学院，成都 611130；2.四川农业大学果蔬研究所，成都 611130；3.成都市农林科学院，成都 611130；4.四川省农业科学院植物保护研究所/农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，成都 610066）

【目的】探讨外源褪黑素（MT）对盐胁迫下猕猴桃幼苗生理特性的影响，为提高猕猴桃抗盐性提供理论依据。【方法】以当年生美味猕猴桃（Actinidia deliciosa）实生苗为试验材料，通过分别根灌0、0.1、0.5和1 μmol/L MT溶液进行预处理5d后，再全部根灌100 mmol/L NaCl溶液进行胁迫处理12 d，以处理过程全部根灌清水的植株为空白对照，在胁迫处理结束后测定盆栽猕猴桃幼苗的相关生理指标。【结果】与空白对照相比，100 mmol/L NaCl胁迫显著增加猕猴桃叶片相对电导率、过氧化氢（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、抗氧化保护酶（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT））活性，减少可溶性蛋白含量；与仅根灌NaCl溶液的植株（S）相比，根灌不同浓度的MT溶液预处理可使盐胁迫下猕猴桃叶片相对电导率降低11.01%～35.33%，活性氧H2O2含量降低10.64%～34.04%，MDA含量减少9.99%～24.61%，同时缓解可溶性蛋白的降解，增加脯氨酸和可溶性糖含量，使SOD、POD和CAT活性分别提高2.01%～2.71%、49.78%～58.82%和7.19%～26.14%。【结论】MT可有效缓解盐胁迫对猕猴桃幼苗的伤害，以0.1 μmol/L的MT溶液预处理效果最好。

褪黑素；猕猴桃；盐胁迫；缓解作用

土壤盐渍化是农业发展和生态环境所面临的主要危机之一，果树盐碱地栽培研究也是国内外关注的重点。盐胁迫可以引发离子毒害、渗透胁迫和氧化胁迫从而导致代谢紊乱，严重影响果树的生长发育[1]。猕猴桃（Actinidia）在植物分类学上属于猕猴桃科（Actinidiaceae）、猕猴桃属（Actinidia Lindl）植物，是原产于中国的古老野生藤本果树，其果实质地柔软，口感酸甜，含有丰富的微量元素、人体所需的17种氨基酸和丰富的维生素C[2]。已有研究表明，猕猴桃树不耐离子胁迫[3]，因此，提高猕猴桃的抗盐性对保证猕猴桃维持正常的生理水平并获得较为理想的果实产量和品质具有重要意义。褪黑素（melatonin，MT）是一种吲哚类小分子物质，存在于绝大多数生物有机体中[4-5]。MT在植物体中具有多种功能，包括调节植物生长发育，如促进不定根形成、改变花期、延缓叶片衰老等[6-8]。此外，MT通过清除活性氧和自由基，可提高植物对干旱[9]、盐害[10]、重金属[11]、UV 辐射[12]、高温[13]、冷害[14]等多种逆境的抗性。已有研究表明，MT可以缓解盐胁迫对平邑甜茶的伤害，提高苹果砧木的耐盐性[10]；可以提高盐胁迫下番茄果实的品质[15]。目前，有关猕猴桃耐盐性的研究已有一些报道[16-17]，但关于外源MT对盐胁迫下猕猴桃抗逆生理特性的研究还未见报道。本试验通过测定不同浓度外源MT和NaCl胁迫处理下猕猴桃叶片膜脂过氧化、渗透调节调节物质和抗氧化保护酶活性等生理指标，探明外源MT影响猕猴桃盐胁迫响应的生理机制，并筛选出适宜的MT浓度，为合理利用MT解决猕猴桃栽培中的盐害问题和培育耐盐猕猴桃品种提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2016年1—8月在四川农业大学园艺学院人工气候室内进行（30°42′N，103°51′E），以野生美味猕猴桃为试验材料。取饱满的种子经低温层积和变温催芽后，播入装有基质（草炭，椰壳，珍珠岩）的穴盘中，放在（25±2）℃的人工气候室中培养，白昼设置为12 h/12 h，待幼苗完全展开子叶后浇1/2 Hoagland营养液，幼苗长到3叶1心时，洗净幼苗根部泥土，移栽到装有珍珠岩的营养钵（10 cm×10 cm）中，每钵3株。

1.2 试验处理

待幼苗长至5叶1心时，选取长势一致的幼苗分成5组，其中3组分别连续5 d晚上根灌50 mL 0.1、0.5和1 μmol/L MT溶液，其余两组根灌50 mL清水。在最后1次根灌MT溶液的第2天开始盐胁迫处理。任选1组根灌清水的植株作为空白对照（CK），即继续根灌清水，其余4组植株均根灌50 mL浓度为100 mmol/L的NaCl溶液，连续根灌12 d，处理期间定期补充1/2 Hoagland营养液。各处理组分别用 CK（清水）、S（清水+100 mmol/L NaCl）、T1（0.1μmol/LMT+100mmol/LNaCl）、T2（0.5μmol/LMT+100 mmol/L NaCl） 和 T3（1μmol/L MT+100 mmol/L NaCl）表示，每处理组10钵，重复3次。处理结束后分别采取各组植株根基向上3～5位叶的叶片用于各项生理指标测定。

1.3 测定项目及方法

相对电导率和H2O2含量测定参照张以顺[18]的方法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[18]；游离脯氨酸含量测定采用李合生[19]的方法；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[19]；可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[19]；采用氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性[19]；采用愈创木酚显色法测定过氧化物酶（POD）活性[19]，用分光光度法测定过氧化氢酶（CAT）活性[19]；上述指标均以鲜叶为材料，重复测定3次以上，以平均值作为各处理的实测值。

1.4 数据处理

采用Excel 2010进行数据统计，以平均值±标准差（SD）表示；用SPSS 22.0进行显著性分析，运用one-way ANOVA方法进行Duncan检验（P＜0.05）；采用Sigma Plot 12.0进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片膜脂过氧化和活性氧含量的影响

植物细胞膜是逆境胁迫攻击的对象，由图1A可以看出，盐胁迫使猕猴桃叶片的相对电导率升高，S的相对电导率最高，达到61.86%，比CK升高了70.80%。外源MT预处理显著抑制了相对电导率的升高，T1的相对电导率为40.00%，比S降低了35.33%，降幅最大。随MT浓度升高，其抑制作用减弱，相对电导率均升高，T2和T3仅比S分别降低26.25%和11.01%（图1A）。H2O2是植物体的内源活性氧化合物，盐胁迫导致猕猴桃叶片H2O2大量积累，S的H2O2含量最高，为65.82 μmol/g，是CK的1.86倍。外源MT预处理可降低盐胁迫下H2O2含量，其变化趋势与相对电导率一致，T1、T2和T3分别比S降低34.04%、22.70%和10.64%（图1B）。MDA是膜脂过氧化的产物，也是反映细胞膜被破坏的标志性物质，盐胁迫下猕猴桃叶片的MDA含量显著升高，S的MDA含量最高，为5.06 nmol/g，比CK增加了61.93%，而外源MT预处理可降低盐胁迫下MDA含量，T1、T2和T3分别比S降低24.61%、21.96%和9.98%，其中T1与T2的MDA含量差异不显著（图1C）。

图1 外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃叶片相对电导率（A）、H2O2含量（B）和MDA含量（C）的影响Figure1 Effects of exogenous melatonin on relative conductivity（A），H2O2content（B）and MDA content（C）of kiwifruit leaves under salt stress

2.2 外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

由图2可知，盐胁迫使可溶性糖含量升高，S的可溶性糖含量为3.13%，比CK增加了33.32%。MT预处理各组的可溶性糖含量差异显著且均高于CK和S，且随MT浓度增加而增幅减小，其中T1可溶性糖含量最高，为3.73%，比CK增加了58.72%（图2A）。盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片中脯氨酸含量也显著增加，T1的脯氨酸含量为521.14 μg/g，相比于CK，其增幅最大，达到74.95%；其次是T2，较CK增加了59.95%，S和T3分别增加了19.46%和27.44%，但两者差异不显著（图2B）。盐胁迫下猕猴桃叶片中可溶性蛋白含量显著下降，S的可溶性蛋白含量最低，为5.34 mg/g，较CK下降了28.76%，T1的可溶性蛋白含量为6.97 mg/g，较CK降幅最少，为6.96%，T2和T3分别较CK减少了11.37%和18.11%（图2C）。

2.3 外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片保护酶活性的影响

盐胁迫下猕猴桃叶片中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性均升高，外源MT预处理也使其活性显著增加。单独盐处理（S）时 SOD活性为 884.02 U/g，显著高于 CK；T1的SOD活性最高，为907.99 U/g，比S高2.71%，其次是T2，比S升高2.01%，而T3的SOD活性与S和CK均差异不显著（图3A）。盐胁迫下POD活性变化幅度较大，S的POD活性为5334 U/（g/min），是CK的1.9倍，T1和T2的POD活性分别比S增加了58.82%和49.78%，但两者差异不显著，而T3与S的POD活性差异不显著（图3B）。另外，盐胁迫下各处理的CAT活性均显著升高，其中T1的CAT活性最高，为8.58 U/（g/min），比S增加26.14%，S、T1和T3显著高于CK，但三者之间不存在显著差异（图3C）。

图2 外源褪黑素对干旱胁迫下猕猴桃叶片可溶性糖含量（A）、脯氨酸含量（B）和可溶性蛋白含量（C）的影响Figure2 Effects of exogenous melatonin on soluble sugar content（A），Proline content（B）and soluble protein content（C）of kiwifruit leaves under salt stress

图3 外源褪黑素对盐胁迫下猕猴桃叶片SOD活性（A），POD活性（B）和CAT活性（C）的影响Figure3 Effects of exogenous melatonin on SOD activity（A），POD activity（B）and CAT activity（C）of kiwifruit leaves under salt stress

3 讨论

细胞内一价离子（Na+，K+）与二价离子（Ca2+）的平衡维持着细胞质膜的完整性和选择透过性，而NaCl胁迫使细胞内Na+浓度升高，破坏了离子平衡，导致细胞膜透性增大[20]；盐渍条件还导致植物体内源活性氧大量积累，诱发膜脂过氧化生成MDA损害膜的正常功能，影响细胞代谢，对植物产生伤害[21]。本研究结果表明，外源0.1～1 μmol/L MT预处理显著降低了盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片的相对电导率和H2O2含量，抑制MDA积累，这与王伟香等[22]的结论一致，其作用机理可能是MT作为抗氧化物质参与到细胞活性氧清除过程，使活性氧维持在相对较低的水平，同时抑制膜脂过氧化，保护膜结构的稳定性，从而减轻盐胁迫对猕猴桃幼苗的伤害。

有研究认为脯氨酸积累可维持细胞膨压，保护酶与膜系统免受毒害，从而提高植株抗盐性，是植物对盐胁迫的适应[21]。可溶性糖是大多数非盐生植物的主要渗透调节剂，可以稳定细胞膜和原生质胶体，也可以在细胞内无机离子浓度较高时起到保护作用[23]。本试验中，外源MT预处理促进了盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片中的脯氨酸和可溶性糖积累，说明其积累是对盐胁迫的适应，MT能调控植株脯氨酸和可溶性糖的代谢，增强猕猴桃幼苗的耐盐性。逆境胁迫下，植物中正常的可溶性蛋白降解或其合成受到抑制，也可能有新的蛋白被诱导合成[24]。本试验表明，盐胁迫下猕猴桃幼苗中可溶性蛋白减少，这与田晓艳[25]等的结果一致；而外源MT预处理可提高可溶性蛋白的含量，可能是MT抑制了可溶性蛋白的降解，或诱导了更多新蛋白的合成。

保护酶系统中的SOD、POD和CAT主要作用是清除活性氧自由基，防止其过度累积。SOD可以催化体内的歧化反应，使超氧自由基转化为H2O2和O2，H2O2再通过 CAT和POD分解成没有毒害的H2O和O2，从而使需氧生物体免受伤害[26]。本研究结果表明，盐胁迫下SOD、POD和CAT活性均升高，可能是活性氧的积累诱导了保护酶的合成；外源MT预处理显著提高了3种酶的活性，使其协同作用清除超氧自由基，缓解了盐胁迫对猕猴桃幼苗的伤害。其作用机理可能是MT与细胞内受体结合，诱导保护酶基因表达，提高保护酶活性[27]。另外，MT预处理组的POD和CAT活性增幅均比SOD大，因此猜测MT主要诱导POD和CAT酶基因表达。

综上所述，根灌MT预处理可使盐胁迫下猕猴桃幼苗叶片相对电导率降低，减轻膜脂过氧化程度，减少MDA的积累，降低活性氧H2O2含量，缓解可溶性蛋白的降解，增加脯氨酸和可溶性糖含量，提高保护酶活性。推测MT作为抗氧化物质参与到细胞活性氧清除过程，同时抑制膜脂过氧化，通过诱导抗氧化酶基因的表达增加其活性从而提高植株抗氧化能力，减轻盐胁迫对猕猴桃幼苗的伤害，并且0.1 μmol/L的MT溶液预处理效果最好。但是MT具体调控这些生理代谢的机制还有待进一步研究。

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Alleviation of Exogenous Melatonin on Kiwifruit Seedlings under Salt Stress

NIZhi-you1，XIAHui1，2，GAOFan1，LIUJi3，HURong-ping4，LIANGDong1，2*
（1.College of Horticulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.Institute of Pomology and Olericulture，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；3.Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Chengdu 611130，China；4.Institute of Plant Protection，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/MOA Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China，Chengdu 610066，China）

【Objective】This study aimed to investigate the effect of exogenous melatonin(MT)on the physiological characteristics of kiwifruit seedlings under salt stress and to provide a theoretical basis for improving salt tolerance of kiwifruit.【Method】One-year-old Actinidia deliciosa seedlings were watered with 0，0.1，0.5 and 1 μmol/L of exogenous melatonin solution for 5 days in a row，respectively.Then they were all rhizospheric treatment with 12-day 100mmol/L NaCl solution.Water irrigation in the whole process was used as the blank control.The related physiological indexes of kiwifruit seedlings were determined after stress.【Results】The relative conductivity，malondialdehyde(MDA)，hydrogen peroxide(H2O2)，solublesugar，proline，protectiveenzyme(superoxidedismutase，SOD，peroxidase，PODandcata－lase，CAT)of kiwifruit seedlings were increased significantly and the content of soluble protein was reduced under salt stress compared with the control(CK).Compared with plants only irrigated with NaCl solution(S)，the relative conductivity of kiwifruit leaves was reduced by 11.01%～35.33%，the content of reactive oxygen species(H2O2)was decreased by 10.64%～34.04%，and the content of MDA was lowered by 9.99%～24.61%in the plants pretreated with different concentrations of MT solution under salt stress.At the same time，the soluble protein degradation was slowed down;both proline and soluble sugar were increased;and SOD，POD and CAT were increased by 2.01%～2.71%，49.78%～58.82%and 7.19%～26.14%，respectively.【Conclusion】The damage of kiwifruit seedlings under salt stress was alleviated by MT and the pretreatment with 0.1 μmol/L MT solution was the most significant.

melatonin；kiwifruit；salt stress；alleviation

S663.4；Q945

A

1000-2650（2017）04-0535-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.012

2017-06-09

四川省国际猕猴桃生物技术育种平台项目（2016NZ0105）；四川省科技厅重点研发项目（2017FZ0022）。

倪知游，硕士研究生。*责任作者：梁东，博士，副教授，硕士生导师，主要从事果实品质调控研究，E-mail：liangeast@sina.com。

（本文审稿：李 宝；责任编辑：巩艳红；英文编辑：徐振锋）