辛亚龙 ，唐军荣 ，杨宇明 ，原晓龙 ，李 斌 ，辛培尧 ，王 娟

（1.西南林业大学 a.国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室；b.云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省林业科学院 a.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室；b.国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护与繁育重点实验室，云南 昆明 650204）

牛樟组织培养技术研究

辛亚龙1a，1b，唐军荣1a，1b，杨宇明2a，2b，原晓龙2a，2b，李 斌1a，2b，辛培尧1a，2b，王 娟2a，2b

（1.西南林业大学 a.国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室；b.云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224；2.云南省林业科学院 a.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室；b.国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护与繁育重点实验室，云南 昆明 650204）

以从台湾地区引进的珍贵树种牛樟带叶腋的幼嫩茎段为外植体，研究不同培养基和植物生长调节剂组合对牛樟组培快繁的影响。结果表明：牛樟幼嫩茎段经处理后用75%乙醇处理5 s，0.1% 升汞处理8 min后，其污染率仅为5.14%。较适宜的腋芽诱导培养基为MS＋6-BA2.0 mg/L＋IBA0.1 mg/L，增殖培养基为MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.4 mg/L，而1/2 MS+NAA0.4 mg/L+IBA0.4 mg/L+活性炭（AC）0.3 mg/L为较理想的牛樟生根培养基。开展牛樟组培快繁进行研究，对其种质资源的保护、遗传改良以及其工厂化生产有着重要的理论研究意义和实践应用价值。

牛樟；组织培养；植物生长调节剂；基本培养基

牛樟Cinnamomum kanehiraeHay隶属于樟科Lauraceae 樟属Cinnamomum，又名“沉水樟”、“黑樟”等，自然分布于广西,广东、湖南、江西、福建及台湾等省区。多生于山坡或山谷密林中或路边或河旁水边[1-2]，是一种极具观赏价值的园林绿化树种。其木质细致，纹理交错，是家具制作、工艺雕刻的上等原料[3]。更为重要的是，早期台湾原住民在牛樟树腐朽内壁中空处，或枯死伏倒的阴暗潮湿的表面发现了一种多孔菌，生长极为缓慢，自然产量稀少，将其称为“牛樟芝”[4]。相关研究表明：牛樟芝不仅对化学性引起的肝损伤具有保护作用，能够抑制癌细胞生长，具有抗氧化，抗过敏、增强免疫力、降血压、降血脂、预防心血管疾病的功效。这使得牛樟芝在医药行业、食品行业，甚至化妆品行业都具有极高的研究及商业价值[5-6]。牛樟芝作为珍贵的药用真菌在台湾地区被称为“药中之王”、“森林中的红宝石”[7]。由于牛樟椴木可用于培养牛樟芝，使得牛樟天然林得到广泛开发的同时造成人为盗伐严重。现存天然林多分布于交通不便的高海拔山区，林分中多逾龄老树，母树分散，授粉不易,且种子易受鸟兽取食，采种困难，偶有天然下种，也因林下光照不足、枯枝落叶过厚使种子不能自然萌发，导致牛樟自然更新困难[8]。目前，该树种野生资源匮乏，濒危程度还在不断加剧，已被列为国家三级重点保护植物[9]。应用人工快繁技术，加快扩大牛樟资源数量，解除种群濒危状态，同时为牛樟芝人工培育提供优良的专性寄主，为生物医药产业发展提可持续的牛樟资源已显得非常重要和十分的迫切。

组织培养技术是解决林业生产用种苗急缺的有效方法之一[10]。关于牛樟的组织培养已有相关报道[3,11-13]，但因不同的地理种源、引种区的生境条件及其培养环境的差异性，在实际应用中存在不可重复性和稳定性不高的局限性，不利于对牛樟开展标准化与规模化的生产。本试验以牛樟嫩茎为启动培养材料，探讨牛樟不定芽诱导、增殖以及生根培养配方，建立高效、稳定、重复性好的牛樟组织培养技术，挽救和扩大牛樟种质资源，加快解除牛樟的濒危状态，并为种质改良和建立人工无性系快繁体系及其工厂化生产提供理论依据和产生实践指导。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料采自云南省普洱市思茅区曼歇坝台湾种源牛樟引种试验基地，五月份采集母树上当年生的健壮、无病虫害带叶腋的嫩枝带回实验室，备用。

1.2 方法

1.2.1 材料预处理

所采集的嫩茎去除叶片并保留1～2 cm长的叶柄，先用试管刷将嫩枝表皮轻轻擦洗后用自来水冲洗30 min，再切成4～6 cm长茎段，方便后续消毒。

1.2.2 外植体的消毒

将上述处理材料移入超净工作台用75%的酒精和0.1%的升汞进行消毒。酒精消毒时间为3、5、8 s；升汞消毒时间分别为5、8、10 min。将消毒完成的嫩茎用无菌水冲洗5次，切除茎段两端及叶柄端部，并使茎段长度保持在1～1.5 cm左右，每段带有1个腋芽，接种于MS＋6-BA1.0 mg/L＋IBA0.1 mg/L培养基中，用以筛选较佳的外植体消毒时间。试验共设9个处理，每个处理10瓶，每瓶接种材料3个，每处理重复3次。

1.2.3 基本培养基的筛选

选择MS，B5、White、WPM为基本培养基，分别加入1.0 mg/L的6-BA和0.1 mg/L的IBA培养40 d后，统计出芽时间、出芽率、芽的生长情况，从而筛选较佳的基本培养基类型。试验共设4个处理，每个处理10瓶，每瓶接种材料3个，每处理重复3次。

1.2.4 外植体的诱导

以1.2.3中筛选出的较佳培养基为腋芽诱导基本培养基，分别添加1.0、2.0、3.0 mg/L的6-BA和0.1、0.2、0.3 mg/L的IBA，外植体诱导40 d后，统计发芽率、芽均高，芽的生长情况，筛选不定芽诱导的较佳生长调节剂配比。试验共设9个处理，每个处理10瓶，每瓶放置材料3个，每处理重复3次。

1.2.5 增殖培养基的筛选

以1.2.3中选出的较佳培养基为增殖培养基本培养基，分别添加0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L的6-BA和0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L的NAA，用以筛选较佳的增殖培养配方。选取诱导培养中获得的健壮的单个芽苗，接种于不同植物激素组合的培养基上进行培养，40 d后统计增殖系数，芽的生长情况。试验共设16个处理，每处理20瓶，每瓶放置材料3个，每处理重复3次。

1.2.6 生根培养基的筛选

以1/2MS培养基为生根基本培养基。分别添加 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L的 NAA 和 0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L的IBA以及0.3 g/L的活性炭（AC），筛选较佳的生根培养配方。选取增殖培养中获得的生长健壮、长约2.0～3.0 cm以上的单株芽苗接种于培养基中，30 d后统计平均生根率，根的长势。试验共设计16个处理，每个处理20瓶，每瓶放置材料3个，每处理重复3次。

1.2.7 培养基质和培养条件

上述所有培养基均加入琼脂5.0 g/L用以固化，蔗糖浓度30.0 g/L，pH=5.8～6.0；室内培养温度25 ℃左右；光照强度1 200 Lx，光照周期12 h/d的条件下进行培养。

1.3 数据分析

污染率=外植体污染数/接入的外植体总数×100%。

死亡率=外植体死亡数/接入的外植体总数×100%。

出芽率=出芽的外植体数/接入的外植体总数×100%。

增殖系数=继代所得的芽数/原接种芽数。

生根率=生根株数/接入生根的芽苗总数×100%。

采用 SPSS 19.0及Excel 2007软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对外植体消毒效果的影响

不同的消毒处理方法对牛樟外植体消毒的效果存在显著差异。由表1可以看出：处理1-3、4-6、7-9的污染率都随着升汞消毒时间的增加而减小，且变化明显；处理3、6、9中75%的乙醇消毒时间达到了8 s，此时的死亡率、褐化率均明显高于其他组合，而污染率呈下降趋势。不同处理间，外植体的死亡率存在显著差异。其中，处理9的死亡率最高，为15.61%。而处理1、2、3、4、5的死亡率较低，分别为0%、0%、0.41%、0.22%和3.67%，且这5个处理间差异不显著；随着升汞处理时间的增加，外植体的污染率逐步下降。其中，处理1的污染率最高（为27.78%），且与其它8个处理均存在显著差异。处理8和9的污染率较低，分别为1.48% 和1.72%，而处理5中，其污染率虽较处理8和9高，但也处于一个较低水平（为5.14%）。就褐化率而言，处理9中的最高，达到19.99%。褐化率较低的是处理4和5（分别为1.69%和1.66%），两处理间无显著差异，但与其它处理均存在显著差异。而处理4中有着较高的污染率。

综上所述可见，牛樟嫩茎作为外植体消毒时，宜选择处理5为较佳消毒方法，即：用75%乙醇处理5 s，0.1% 升汞处理8 min时效果最佳。

2.2 不同基本培养基对芽诱导效果的影响

接种40 d后，观察芽的生长状况并对数据进行方差分析，其结果列于表2。

采用MS为基本培养基，外植体于21.5 d内即可出芽，其出芽率达86.67%，且与其它处理均差异显著。该处理中发出的芽，呈翠绿色，且生长旺盛，较健壮，后期叶片和茎生长正常；采用WPM培养基出芽率为54.44%，能抽出新芽，叶片及茎长势旺盛，但后期长势不及MS培养基，且发芽率较低，出芽时间也较长（为26.5 d）；采用B5和White为基本培养基，外植体的腋芽出芽率率分别为63.33%、38.89%，但腋芽生长较小，且缓慢。

表1 不同处理对消毒效果的影响†Table 1 Influence on sterilization effect in different treatments

表2 不同基本培养基对芽诱导的影响Table 2 Influence on bud induction in different basic media

因此认为，MS培养基作为牛樟组织培养的基本培养基效果较为理想。

2.3 不同处理对腋芽诱导效果的影响

以MS培养基为腋芽诱导基本培养基，添加不同浓度的6-BA和不同浓度的IBA进行外植体腋芽诱导培养基配方的筛选，其结果如表3所示。

由表3可知，随着6-BA浓度的加大，发芽率逐渐升高，在处理9中达到了85.56%；随着IBA浓度的升高，愈伤组织形成也逐渐加大，而发芽率有先升后降的趋势。处理4、5、6、7、8的发芽率在87.78%～91.11%之间，且这5个处理间无显著差异；40 d后统计苗高，处理4、6、5中的苗均较其他处理高（分别为2.7、2.58和2.5 cm），这3个处理间差异不显著但与其它处理均有显著差异。因此，处理4、5、6均可作为牛樟嫩茎腋芽诱导的较优方案，但是从工厂化生产的需要考虑，宜选择处理4为最理想的培养方案，既保证了腋芽诱导效果和质量，又可以减少生产成本（图1）。即：MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA0.1 mg/L为牛樟腋芽诱导的最佳培养基配方。

表3 不同处理下腋芽诱导效果比较Table 3 Comparison on inducing axillary buds in different treatments

图1 牛樟腋芽诱导Fig.1 Axillary bud induction from Cinnamomum kanehirae explants

2.4 不同处理对不定芽增殖效果的影响

选取生长正常的腋芽，以试验筛选出的MS培养基为基本培养基，分别添加不同浓度的6-BA和NAA进行增殖培养配方的筛选，40 d后进行观察，并统计增殖率及芽的生长情况，其结果如表4所示。

表4显示，随着6-BA浓度的增加，不定芽的增殖系数逐步增高。处理12、13、14、15和16中均获得了较高的增殖系数，但这5个处理中芽的玻璃化程度较重、茎基部松散愈伤组织较多，有叶片卷曲变形的现象，不利于不定芽的增殖培养；处理10和11中，其增殖系数分别为3.67和3.62，这2个处理间虽然无显著差异，但比较芽的生长情况，则以处理10较优。同时，从工厂化生产的经济角度考虑，也是处理10较为理想（图2）。因此认为，处理10（MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.4 mg/L）为牛樟不定芽增殖的较理想培养方案。

表4 不同处理下不定芽的增殖效果Table 4 Effect comparison on adventitious bud proliferation in different treatments

图2 牛樟增殖培养Fig.2 Multiplication culture of Cinnamomum kanehirae

2.4 不同处理对生根效果的影响

对不同处理中不定芽苗的生根效果进行统计分析可知，处理5、9、6和7中的不定芽具有较高的生根率（87.0%～92.0%），且这4个处理间不存在显著差异（见表5）。而参考根的生长情况，处理6中的根较粗壮、根数多、根部洁白且无愈伤组织产生，因此认为，处理6（1/2 MS+NAA0.4 mg/L +IBA0.4 mg/L+AC0.3 g/L）为牛樟生根培养的较理想配方（图3）。

表5 不同处理的生根效果Table 5 Effect comparison on rooting in different treatments

图3 牛樟生根培养Fig.3 Rooting culture of Cinnamomum kanehirae

3 讨 论

试验发现以5月份采集的嫩茎为材料，进行消毒试验，消毒效果好，成活率高，且长势旺盛，后期曾采集7月份新发的嫩茎，采用相同的消毒方法进行试验，其污染率高达90%，这是由于当地进入雨季空气潮湿，气温较高，植物生长繁茂，植物表面各类杂菌增多，外界环境和节气的改变引起植物体内内源激素含量变化[14-16]，试验中外植体的采集时间对于消毒效果影响十分明显，外植体采集应以植物生长旺盛的3―5月为最佳时期，此时间段内，空气中杂菌少，植物内源激素含量高，生长旺盛，适合取材，采集消毒容易，成活率高，周新华等[17]、官锦燕等[12]在相关研究中，对外植体的采集时间也提出了相似的看法。

刘荣忠等[11]在对牛樟进行腋芽诱导时，采用MS＋6-BA2.0 mg/L＋NAA0.5 mg/L的培养基，官锦燕等[12]采用了MS＋6-BA1.0 mg/L＋IBA0.1 mg/L的培养基进行牛樟的腋芽诱导，而周张德堂[3]则认为，WPM＋6-BA1.5 mg/L＋IBA 0.1 mg/L较适合牛樟腋芽的诱导，其诱导率分别为58.3%、88.2%和80%；本试验发现，外植体在MS＋6-BA2.0 mg/L＋IBA0.1 mg/L的培养基中，其诱导效果最佳，诱导率（91.11%）也较以前学者所得的要高。已有研究表明[3,11-12]，利用适宜的增殖培养基，可使牛樟不定芽增殖系数达到2.80～4.29，本试验采用MS+6-BA1.5 mg/L＋NAA0.4 mg/L的增殖培养基，使牛樟不定芽的增殖系数达到3.67，且所增殖的不定芽苗长势良好。在组培研究时须注意到，影响植物离体培养的因素是多方面的，包括离体器官的基因型，外植体的选择、继代培养的次数、培养基成分、培养条件等都会影响组培快繁重效果[18]。本试验表明，牛樟组织培养时，以MS培养基为基本培养基可获得较优的培养效果。这与刘荣忠等[11]、官锦燕等[12]与林新春等[13]的相关研究相一致。而与周张德堂[3]的研究有所不同，他认为WPM为牛樟组织培养的较理想的基本培养基。不同的研究者所得的结论有所出入，这可能与所采外植体基因型的不同有关。同一物种，由于引种到不同的生长环境中，或有性繁殖，往往造成其基因型的变异[19]。而同一种植物的基因型种类，往往是引起组织培养条件各异的主要原因之一[20]。这可能也是已有研究报道重复性及稳定性不高的主要原因。因此，在利用所建立的组织培养体系进行工厂化生产时，应特别注意取材条件及材料基因型的一致性，从而确保技术体系的可重复性和稳定性。

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Study on tissue culture ofCinnamomum kanehiraeHay

XIN Yalong1a,1b, TANG Junrong1a,1b, YANG Yuming2a,2b, YUAN Xiaolong2a,2b, LI Bin1a,2b, XIN Peiyao1a,2b,WANG Juan2a,2b
(1.Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest Region of State Forestry Administration, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 2.Yunnan Academy of Forestry, Kunming, 650204, China; 3.The Key Laboratory of Forest Plants Cultivation and Utilization,/The Key Laboratory of Rare and Endangered Forest Plants of State Forestry Administration, Yunnan Kunming, 650204, China; 4.Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China)

The tender stem segments with leaf axil ofCinnamomum kanehirae, a rare tree species introduced from taiwan province, were used as explants to study the in fluence on its tissue culture in different culture medium and treatment of plant growth regulators. The results showed that: After treatment, the tender stem segments ofC.kanehiraewere disinfect with 75% alcohol for 5 s and 0.1% mercuric for 8min. The contamination rate was 5.14%. MS＋6-BA2.0 mg/L＋IBA0.1 mg/L was the suitable culture medium for axillary bud induction, while the proliferation culture medium was MS+6-BA1.5 mg/L+NAA0.4 mg/L. The culture medium of 1/2 MS+NAA 0.4 mg/L+IBA0.4 mg/L+ AC0.3 mg/L could obtain the ideal rooting effect. Study ofC.kanehiraetissue culture has the Important theoretical and practical signi ficance to its germplasm resources protection,genetic improvement and factory production.

Cinnamomum kanehiraeHay; tissue culture; plant growth regulator; basic culture medium

S723.1＋32

A

1673-923X(2017)08-0048-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2017.08.009

2017-02-20

国家林业局云南珍稀濒特植物保护与繁育重点实验室开放项目（2016-02）；云南省科技计划项目(2015IA004)；云南省森林植物培育与开发利用重点实验室开放项目（2016-02）

辛亚龙，硕士研究生

辛培尧，副教授，博士；E-mail：xpytgyx@163.com；王 娟，教授，博士；E-mail：schima@163.com

辛亚龙，唐军荣，杨宇明，等. 牛樟组织培养技术研究[J].中南林业科技大学学报，2017, 37(8): 48-53.

[本文编校：文凤鸣]