刘 芳，李净洋，邱 烨，许妍姬

(延边大学医学院 预防医学教研室，吉林 延吉133002)

刺五加皂苷对淀粉样前体蛋白APP酶解通路的影响

刘 芳，李净洋，邱 烨，许妍姬*

(延边大学医学院 预防医学教研室，吉林 延吉133002)

目的研究刺五加皂苷对APP(Amyloid Precursor Protein，APP)酶解通路的影响。方法(2015.9-2016.5)用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷处理胚鼠皮层神经元细胞，采用酶联免疫吸附测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测γ-分泌酶活性；另用脂质体2000转染构建APP695高表达CHO细胞系,用G418(500 mg/L)进行筛选获得APP695-CHO稳转染细胞，用12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L刺五加皂苷处理稳转染细胞，48 h后，ELISA法检测细胞培养上清中Aβ1-40含量，用Western-blot法检测细胞裂解液中APP-N端片段蛋白的表达。结果在胚鼠皮层神经元细胞与对照组相比，25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷能够抑制内源性γ-内切酶的活性，而且随着浓度的升高，抑制作用增强；在APP695-CHO稳转染细胞中，Aβ1-40的分泌量增高，APP-N端片段的蛋白表达水平减少，不同剂量刺五加皂苷能缓解这些变化。结论刺五加皂苷能抑制内源性γ-内切酶减少Aβ1-40的生成，对APP酶解起到一定的影响，对阿尔茨海默病的发病及进展有一定的保护作用。

刺五加皂苷；β淀粉样蛋白；γ-内切酶；阿尔茨海默病；APP-N端片段

(ChinJLabDiagn,2017,21:2173)

1 材料与方法

1.1材料

CHO细胞株来自于上海良一医药科技有限公司。APP695是由韩国首尔医科大学药理学教室徐裕宪教授馈赠。刺五加皂苷购于上海源叶生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、LB培养基、DAPT(γ-内切酶抑制剂)、G418、青霉素、链霉素、氨苄青霉素(Amp)、DH-5α购于碧云天生物科技有限公司；DMEM培养液、青霉素、链霉素、氨苄青霉素(Amp)、胰蛋白酶(Sigma);胎牛血清(Corning，N.Y,14831，USA)；NDiff Neuro-2(N2)培养基补充剂购于德国默克密理博公司； QIAGEN Plasmid Maxi Kit 购于QIAGEN; Lipofectin2000从invitrogen公司购买；人β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)酶联免疫分析、大鼠γ-分泌酶(γ-Secretase)酶联免疫分析试剂盒购于上海酶联(mlbio)生物公司。

1.2实验仪器

CO2培养箱、低速容量离心机、电泳仪、立式压力蒸汽灭菌器、冷冻离心机、恒温培养箱、酶标仪、恒温振荡器、紫外分光光度计等均由延边大学医学院预防医学教研室提供。

1.3实验方法

1.3.1质粒的扩增和抽提

把含有重组质粒V-Flag-APP695和空载体V-Flag的菌种放入含氨苄青霉素(Amp)的固体培养基中，先经过小培养，然后转入到大培养。根据质粒抽提试剂盒来提取质粒，并测定质粒的浓度和纯度。

要形成以学生为主体的教学课堂，使学生作为课堂知识的主要吸收者和接受者。通过课堂教学发表自身的意见和看法，并从每节课的学习中不断积累自身的知识储备。语文作为一门从小就接触的学科，对学生的成长成才起着关键的作用。因此，学生在学习语文的过程中要摆正自身的姿态，积极主动地去学习和探索语文的知识。例如，关于作文的写作方面，在写到关于人文素养题材的作文时，教师可以引用一些有关此题材的故事，或优秀作文，让学生自主进行讨论，从中汲取此类题材的关键点进行构思和框架的构建，这也是提升个人人文素养的一个途径。

1.3.2CHO细胞培养

把CHO细胞培养于37℃、5% CO2条件下的二氧化碳培养箱中。

1.3.3细胞转染

依照转染试剂盒说明书，把APP695基因转染到CHO细胞中，用G418(500 mg/L)筛选阳性克隆，再用Western-blot检测APP-N端片段蛋白的表达。

1.3.4胚鼠皮层神经元细胞培养

取怀孕16-18 d的SD大鼠，乙醚麻醉取出胚胎，放入D-hank’s液中，将胎鼠断头取大脑皮层组织，将其剪碎消化分解后，终止消化，离心去上清，再用DMEM培养液吸打静止后，接种到六孔板中，于CO2培养箱中过夜，次日换成有1%N2的DMEM培养液，第四天再换成含有10%胎牛血清、5%马血清的DMEM培养液，7 d后给予续处理。

1.3.5放射免疫法测定Aβ1-40含量

空质粒转染对照组、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷和γ-内切酶抑制剂5 μmol/L DAPT分别处理转染后的细胞，48 h后收集细胞培养液，依照人β淀粉样蛋白1-40(Aβ1-40)酶联免疫试剂盒的要求测定Aβ1-40的含量。

1.3.6ELISA法测定γ-内切酶活性

分别向胚鼠神经元细胞中加入12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L的刺五加皂苷，48 h后收集培养液，按照γ-分泌酶ELISA试剂盒的说明书操作，酶标仪测定吸光度，计算得出γ-内切酶的浓度。

1.3.7APP-N端片段蛋白水平检测

采用蛋白印迹法测定蛋白水平。细胞获取蛋白后进行电泳实验，以β-tubulin作为内参照，计算蛋白表达水平。

1.3.8统计分析

采用SPSS17.0统计软件进行统计处理，计量资料以表示，多个样本均数比较，采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1Aβ1-40含量比较转染APP695-V-Flag模型组与转染空载体V-Flag对照组比较，Aβ1-40的含量明显增加(P<0.05，表1)；DAPT处理组、刺五加皂苷低、中、高剂量组与模型组相比，Aβ1-40含量明显降低，具有显著性差异(P<0.05)。

表1 刺五加皂苷对CHO/APP695细胞中Aβ1-40含量的影响

与对照组比较，△代表P<0.05；与模型组比较，*代表P<0.05

2.2刺五加皂苷对γ-内切酶活性的影响胚鼠皮层原代培养细胞DAPT处理组跟空白对照组比较，γ-内切酶活性明显下降；刺五加低、中、高剂量组γ-内切酶活性与空白对照组比较明显降低(P<0.05,表2)。

表2 刺五加皂苷对胚鼠神经元细胞内源性γ-内切酶活性的影响

与正常对照组比较，*代表P<0.05

2.3APP-N端片段蛋白表达水平测定转染重组质粒V-Flag-APP695组比转染空载体V-Flag组蛋白表达水平明显增加，DAPT+APP695处理组比APP695处理组蛋白表达水平有所增加，刺五加皂苷(低、中、高)+APP695处理组与APP695模型组相比较，APP-N端蛋白表达水平升高,具有显著性差异(P<0.05，图1)。

*代表与模型组比较P<0.05,#代表与对照组比较P<0.05

3 讨论

阿尔茨海默病(AD)是β淀粉样蛋白(amyloid-β protein，Aβ)积累的结果，是淀粉样前体蛋白(APP)经β和γ-分泌酶水解而产生[6]，而γ-分泌酶切割APP产生的疏水性Aβ40是形成Aβ的主要原因，所以γ-内切酶是APP水解产生Aβ的关键酶，是防治阿尔茨海默病很有潜力的靶点。γ-分泌酶是产生Aβ的限速酶，直接关系到AD的发病与否，能切割各种Ⅰ型跨膜蛋白,包括 APP 和 CD44等[7,8]。

γ-分泌酶抑制剂(GSIS)已用于临床研究,但如DAPT或其他γ-分泌酶抑制剂和β-分泌酶抑制剂，由于药物用药的安全性以及其长时间应用时出现的副作用，不适于长期使用。所以我们必须找到长期比较安全使用的一些组分，这些保护成分可以来自从中草药或微量元素或食品。因此，本次研究我们观察了刺五加皂苷对APP的酶解途径的影响。结果显示，刺五加皂苷可以抑制γ-内切酶的活性，进而减少Aβ1-40的产生，其APP-N端蛋白表达水平升高。在HT22细胞和稳定表达Sweidish 突变型APP的SH-SY5Y细胞中，Shi Chung等人报道人参皂甙Rg1促进APP非淀粉样酶切通路，增加α-分泌酶的活性以及细胞外的Aβ1-40和分泌型sAPP(α)的含量，阐明了人参皂甙Rg1对老年性痴呆酶解通路的干预作用[9]。Koivisto等人报道鱼油含EPA和DHA，可以缓解老年性痴呆模型APPswe/PS1dE9 转基因小鼠的认知障碍和脑部淀粉样蛋白的沉积，其机制为降低β-分泌酶和γ-分泌酶的活性减少Aβ1-42的含量[10]。我们的研究结果与这些结果保持一致性，刺五加皂苷抑制γ-内切酶的活性，进而减少Aβ1-40的产生，干预老年性痴呆酶解通路，可以起到预防和治疗老年性痴呆有保护作用。

刺五加皂苷具有调控心脑血管系统，抑制癌细胞增殖，降低糖尿病，抗炎，增强免疫力，抗疲劳等药理作用[11]。刺五加含有超氧化物歧化酶复合物，具有很好的抗氧化功能，可增强免疫力和抗自由基的作用[12]。刺五加皂苷E 和异秦皮啶对Aβ25-35诱导的轴突和树突的萎缩具有明显的保护作用[13]。刺五加皂苷能显著抑制α-synuclein诱导的毒性[14]。刺五加提取物可提高纹状体多巴胺(DA)含量，平衡纹状体的行为激活和抑制作用，保护DA神经元凋亡，减轻帕金森病小鼠的死亡率[15]。之前，我们研究组通过体内和体外实验表明了刺五加对老年性痴呆的保护作用，刺五加皂苷对Aβ25-35诱导PC12细胞的细胞毒性和细胞凋亡的有较好的保护作用[16]。刺五加提取液对半衰老模型小鼠学习记忆能力减退及脑组织MDA 、SOD、胆碱酯酶(TchE)、单胺氧化酶(MAO)活性变化有较好的保护作用[17,18]，提示刺五加可能的保护机制是其抗氧化作用。这些报道均提示刺五加对神经变性疾病如老年性痴呆或帕金森病有保护作用。

APP是跨膜蛋白，APP经过β-分泌酶和γ-分泌酶的作用下产生Aβ1-40或Aβ1-42，可以被a-分泌酶的作用下产生分泌型APP(SAPP)，最近报道也可以被ε-,δ-,η分泌酶的作用下产生不同的C-端片段[19]。此次研究我们就测定了γ-内切酶的活性和Aβ1-40的含量以及APP-N端蛋白表达水平，今后我们想继续对APP酶解相关的其他酶和相关基因进行更深层次研究，对β-分泌酶、α-分泌酶的活性以及各分泌酶的相关基因如PS1(γ-)、PS2(γ-)、BACE1(β-)、AMDM10(α-)的蛋白质和mRNA水平的表达。综上所述，刺五加皂苷对老年性痴呆有较好的保护作用，其保护作用的分子生物学机制可能是对APP酶解通路的干预作用，其更深的分子生物学机制有待于进一步研究和探讨。

[1]Mhatre SD,Michelson SJ,Gomes J,et al.Development and characterization of an aged onset model of Alzheimer’s disease in Drosophila melanogaster[J].Exp Neurol，2014，261:772.

[2]Fargo K,Bleiler L.Alzheimer’s Association report[J].Alzheimers Dement，2014，10:147.

[3]Choi SJ,Jung SS,You YS,et al.Prevalence of Alzheimer’s dementia and its risk factors in community-dwelling elderly Koreans[J].Psychiatry Investig，2008，5:78.

[4]王 蒙，唐迪莹，李欣欣，等.β淀粉样蛋白及tau蛋白相关机制在阿尔茨海默病中的研究进展[J].中国老年学杂志，2017,37(12)：3101.

[5]周 珂，谭 勇，刘忠第，等.刺五加治疗血管性痴呆的机制和前景[J].世界中医药，2017，12(3)：704.

[6]Marcus O.W.Grimm,Janine Mett,Christoph P.Stahlmann,et al.APP intracellular domain derived from amyloidogenic β-and γ-secretase cleavage regulates neprilysin expression[J].Front Aging Neuroscience,2015,7 :77.

[7] Beel AJ，Sanders CR.Substratespecificity of γ- secretase and other intramembrane proteases[J].Cell Mol Life Sci ,2008，65(9):1311.

[8]韦 云，刘美霞，梁晓东，等.还脑益聪方提取物含药血清对APP/PS1双基因转染细胞γ分泌酶活性及相关蛋白表达的影响[J].中国药理学通报，2017，33(3):417.

[9] Hennariikka Koivistoa,Marcus O.Grimmb,c,Tatjana L.Rothhaarb,et al.Special lipid-based diets alleviate cognitive deficits in the APPswe/PS1dE9 transgenicmouse model of Alzheimer's disease independent of brain amyloid deposition[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2014，25：157.

[10]Shi C,Zheng DD,Fang L,et al.Ginsenoside Rg1 promotes nonamyloidgenic cleavage of APP via estrogen receptor signaling to MAPK/ERK and PI3K/Akt[J].Biochim Biophys Acta,2012,1820(4):453.

[11]黄晓巍，刘玥欣，张啸环.刺五加叶化学成分、药理作用及现代临床应用研究进展[J].吉林中医药，2017,37(6):611.

[12]袁晓勇，赵 阳.刺五加注射液对抑郁大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制[J].新乡医学院学报，2017,34(6)：469.

[13]Y.Bai,C.Tohda,S.Zhu,et al.Active components from Siberian ginseng (Eleutherococcus senticosus) for protection of amyloid beta (25-35)-induced neuritic atrophy in cultured rat cortical neurons[J].J Nat Med,2011,65,417.

[14]See comment in PubMed Commons belowLi XZ,Zhang SN,Lu F,et al.Microarray Expression Analysis for the Paradoxical Roles of Acanthopanax senticosus Harms in Treating α-Synucleinopathies[J].Phytother Res,2016,30:243.

[15]Shu-min Liu,Xu-zhao Li ,Yan Huo,et al.Protective effect of extract of Acanthopanax senticosus harms on dopaminergic neurons in Parkinson's disease mice[J].Phytomedicine,2012,19,631.

[16]元红花，程 琳，许妍姬.刺五加皂苷对Aβ25-35诱发PC12细胞毒性及细胞凋亡的保护作用[J].中国老年学杂志，2014，3(34)：1570.

[17]许妍姬.刺五加对痴呆模型小鼠记忆障碍及MDA含量、SOD和乙酰胆碱脂酶活性的影响[J].中国老年学杂志，2010，9(30)：1238.

[18]许妍姬.刺五加对痴呆模型小鼠记忆障碍及脑组织单胺氧化酶活性改变的保护作用[J].中成药,2009,31(8):1290.

[19]María-Salud García-Ayllón,Inmaculada Lopez-Font,Claudia P.Boix,et al.C-terminal fragments of the amyloid precursor protein in cerebrospinal fluid as potential biomarkers for Alzheimer disease[J].Sci Rep,2017,7:2477.

EffectofAcanthopannxSenticoususSaponinsonprocessingPathwayofAmyloidprecursorprotein

LIUFang，LIJing-yang，QIUYe,etal.

(DepartmentofPreventiveMedicine,YanbianUniversityMedicalCollege,Yanji133002,China)

ObjectiveTo study the effects of Acanthopannx Senticousus Saponins(ASS) on processing pathway of amyloid precursor protein(APP).Methods(2015.9-2016.5)12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to primary culturedrat cortical neuron cells， the activity of γ-secretase was measured by ELISA analysis;The APP695 gene was transfected into CHO cells using Lipper 2000 reagent.Stably transfected cells were sclected by G418(500 mg/L).12.5 mg/L,25 mg/L,50 mg/L of ASS were treated to stably transfected cellsfor 48 hours,ELISA assay was used to detected Aβ1-40concentration in the supernatant of cell culture medium.Western-blot analysis were used to detected the APP-N terminal fragment protein expression from cell lysate.ResultsIn the primary cultured cortical neuron cells,25 mg/L,50 mg/L ASS inhibited the activity of γ-secretase compared with control group,and,the effect of inhibition were enhanced as the concentration increased.The concentration of Aβ1-40was incresedand the expression of APP-N terminal fragment protein were decreased in APP695-CHO stably transfected cells,which all changes were alleviated by different dose of ASS.ConclusionASS could inhibit the activity of endogenousγ-secretase to decreasing Aβ1-40production and influence APP processing may have an protective effect on Alzheimer’s disease pathology.

Acanthopannx Senticousus Saponins；β-amyloid protein; γ-secretase; Alzheimer’s disease；APP-N terminal fragment

吉林省教育厅科学技术研究项目(吉教科合字2016-279号)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2173-04

R285

A

刘 芳(1990-)，女，硕士，研究方向为神经毒理学;许妍姬(1973-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向为神经毒理学。

2017-08-01)