师庆红，秦 迪，赵长福，张 欣，杨照微，黄丽红*，何成彦

(吉林大学中日联谊医院 1.检验科；2.老年病科；3.骨科，吉林 长春130033)

CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响

师庆红1，秦 迪2，赵长福3，张 欣2，杨照微1，黄丽红2*，何成彦1

(吉林大学中日联谊医院 1.检验科；2.老年病科；3.骨科，吉林 长春130033)

目的探讨CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖及细胞周期的影响。方法应用脂质体3000将CLC-3 siRNA转入PASMC。通过免疫印记法测定了CLC-3 siRNA干扰后PASMC的CLC-3表达水平；应用台盼蓝染色计数法计数了细胞增殖；流式细胞仪测定了细胞周期。结果(1)CLC-3 siRNA可降低PASMC的CLC-3表达；(2)CLC-3 siRNA干扰可显著抑制PASMC增殖,与空白对照、阴性对照 siRNA转染组相比P<0.05；(3)CLC-3 siRNA干扰可显著减少PASMC的S期细胞、增加G1期细胞，与空白对照、阴性对照 siRNA转染组相比P<0.05。结论CLC-3 siRNA干扰PASMC表达CLC-3，可抑制PASMC的增殖并影响其细胞周期进程。

肺动脉高压；肺动脉平滑肌细胞(PASMC)；氯离子通道CLC-3；siRNA

(ChinJLabDiagn,2017,21:2171)

肺动脉高压严重威胁着人类健康[1]。研究证实肺小动脉血管增生是肺动脉高压的主要特征之一，肺动脉血管平滑肌细胞(PASMC)增殖在肺动脉高压的发生发展中起关键作用[2]。近年来以其为靶点治疗肺动脉高压取得一定进展。体内多种因素影响心肌及血管平滑肌细胞的增殖，如细胞肿胀激活性氯离子通道(Icl.swelling)及其氯通道CLC-3等[3,4]。在本研究中我们应用CLC-3 siRNA干扰人PASMC表达CLC-3蛋白，初步探讨了干扰其表达对人PASMC增殖及其细胞周期的影响，为进一步深入研究CLC-3在肺动脉高压发病机制中的作用及以其为靶点新的治疗策略奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1人PAMSC的培养

人肺动脉平滑肌细胞(HPAMSC，ScienCell)培养于多聚赖氨酸处理(2 μg/cm2)的培养10 mm培养皿中，培养基为平滑肌细胞生长培养基(ScienCell)，其中含5%胎牛血清、SMCGS、青霉素、链霉素。5%二氧化碳培养箱中，生长至约90%汇合时传代。HPAMSC在5至12代用于本实验。

1.2CLC-3siRNA转染

CLC-3 siRNA由Origene公司合成，序列为：AGCUACAACAGUAUAACAAGUGCAA，阴性对照siRNA由Origene公司提供。转染方法：将分别用125 μl无血清SCM稀释的7.5 μl Lipofectamin 3000 和1 μl CLC-3 siRNA(20 μM)混合，室温孵育15 min，加入接种1×105HPAMSC 的6孔板中，轻轻混匀，培养48 h后进行干扰目的基因表达的检测。

1.3免疫印记法检测CLC-3蛋白表达水平

用细胞裂解液裂解细胞(Gengstar)，制备细胞总蛋白，BCA法测定蛋白含量。经10%SDS-PAGE电泳后转膜，封闭过夜后加入CLC-3多克隆抗体(CST，1∶1 000稀释)、GAPDH多克隆抗体(碧云天，1∶1 000稀释)室温孵育2 h，洗膜后加入HRP-羊抗兔IgG(碧云天1∶1 000稀释)室温孵育1 h，洗膜后加发光试剂(ThermoFisher)，压片、显影、定影后观察记录结果。

1.4细胞增殖的测定

转染48 h后，用0.004%EDTA-0.05%胰酶消化细胞,PBS洗2次，用1%台盼蓝染色计数活细胞数，每组计数3孔。

1.5细胞周期测定

转染48 h后，用0.02%EDTA-0.05%胰酶消化细胞,PBS洗2次后，用200 μl PBS重悬细胞，逐滴加入到预冷的70%乙醇中，4℃保存；24 h后离心，PBS洗3次，加入500 μl含50 mg/ml PI、100 μg/ml RNase A、0.2%Triton X-100的PBS，用流式细胞仪分析细胞周期。

1.6统计学分析

2 结果

2.1CLC-3siRNA对人PAMSC表达CLC-3蛋白的影响

空白对照、阴性对照 siRNA转染及CLC-3 siRNA 转染组细胞，提取细胞总蛋白，通过免疫印记法检测CLC-3蛋白表达水平。结果显示：与PAMSC空白对照、阴性对照 siRNA转染组相比，CLC-3 siRNA组CLC-3表达水平降低，见图1。

2.2干扰CLC-3表达对人PAMSC增殖及细胞周期的影响

转染48 h后，收集空白对照、阴性对照 siRNA转染及CLC-3 siRNA 转染组细胞，计数每孔活细胞数并通过流式细胞仪进行细胞周期分析。结果显示：与空白对照、阴性对照 siRNA转染组相比，CLC-3 siRNA组活细胞数显著减少(P<0.05)；CLC-3 siRNA组S期细胞呈减少、G1期细胞增加，与空白对照、阴性对照 siRNA转染组相比，P<0.05，见表1。

表1 CLC-3 siRNA对人肺动脉平滑肌细胞增殖及细胞周期的影响

*与空白对照、阴性对照 siRNA组相比P<0.05

3 讨论

肺动脉高压是以肺小动脉血管痉挛、肺小动脉血管增生和重构为主要特征的一种疾病。PASMC增殖导致肺小动脉增生及重构，在肺动脉高压病理过程中起关键作用[5]。目前针对PASMC增殖的药物如前列腺环素类似物、内皮素受体拮抗剂等在临床治疗肺动脉高压中取得了一定疗效[6,7]，但疗效仍不理想。近年来研究发现细胞肿胀激活性氯离子通道(Icl.swelling)及其通道基因CLC-3在高血压、心肌缺血/再灌注、心肌肥厚和心力衰竭中发挥重要作用[8,9]。氯离子通道阻滞剂DIDS、DCPIB等可影响PASMC 的增殖，为开发肺动脉高压治疗策略指出了新的方向。在本研究中我们应用CLC-3 siRNA干扰人PASMC表达CLC-3蛋白，初步观察到干扰CLC-3表达不仅可抑制人PASMC细胞增殖，而且也影响其细胞周期进程，使部分细胞阻滞在G1期，进入S期细胞显著减少。本研究结果提示我们：CLC-3是研究PASMC增殖的较理想靶点，干扰CLC-3表达可影响PASMC细胞的 G1/S期转换。本研究为深入探讨CLC-3与肺动脉高压相关性及CLC-3影响PASMC细胞增殖的机制奠定了实验基础。

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CLC-3siRNAeffectsonHumanPulmonaryArterySmoothMuscleCellsProliferationandcellcycles

SHIQing-hong,QINDi,ZHAOChang-fu,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

ObjectiveTo evaluate the effects of CLC-3 siRNA on the proliferation and cell cycles of PASMC.MethodsWe transfect CLC-3 siRNA into PASMC by Lipofectamine 3000 reagent.The expression of CLC-3 protein in PASMC is detected by western blotting after CLC-3 siRNA transfection.The cell proliferation of PASMC is counting by trypan blue staining and the cell cycle of PASMC is analyzed by flow cytometry.Results(1)CLC-3 siRNA can reduce the expression of CLC-3 protein in PASMC.(2)CLC-3 siRNA interference can significantly decrease the proliferation of PASMC,compare to blank control,negative siRNA,P<0.05.(3)CLC-3 siRNA interference can significantly reduce the S phase PASMCs and increase G1 phase PASMCs,compare to blank control,negative siRNA ,P<0.05.ConclusionCLC-3 siRNA can interfere the CLC-3 expression in PASMC,and can decrease the proliferation of PASMC and affect the process of PASMC cell cycle.

Pulmonary hepertension；Pulmonary artery smooth muscel cells(PASMC)；Chloride channel CLC-3；siRNA

国家自然基金项目(81572082);吉林省科技厅资助(2015010153JC,20140311092YY)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2171-03

R543.2

A

2017-03-14)