许甘霏， 官 妍

(1. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601； 2. 安徽中医药大学 中西医结合临床学院， 合肥 230038)

表皮葡萄球菌总RNA小量提取方法比较

许甘霏1， 官 妍2

(1. 安徽大学 生命科学学院， 合肥 230601； 2. 安徽中医药大学 中西医结合临床学院， 合肥 230038)

表皮葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌，因细胞壁较厚、难破裂等特点致使其总RNA提取的难度增大，而总RNA提取效率和提取质量等对分子生物学相关研究起着关键的作用。因此，以表皮葡萄球菌ATCC35984为实验菌株，分别使用Trizol裂解联用研磨珠破碎法、单酶酶解法、双酶酶解法、液氮研磨法等4种细胞壁破碎方法，对其总RNA进行提取，对比提取效果，旨在寻找一种高效稳定的总RNA提取方法。结果显示，双酶裂解法和液氮研磨法提取的表皮葡萄球菌总RNA完整性好、纯度高、重复性好，可有效提高表皮葡萄球菌总RNA提取质量。

表皮葡萄球菌；总RNA；提取方法

近年来，随着人工瓣膜、关节置换、插管等医疗技术临床应用的增多，留置在患者体内的生物材料感染逐渐成为这些技术引起的并发症之一[1]。其中，由表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)引起的感染是临床上最常见感染之一。表皮葡萄球菌是人体皮肤和黏膜的主要共生菌，是一种常见的条件致病菌，同时也是医院交叉感染的重要来源[2]；其可在体内黏附材料表面形成生物被膜，致使其对抗菌药物不敏感，并最终导致表皮葡萄球菌在患者体内难以清除[3]。因此，有关表皮葡萄球菌的基础研究已引起科研工作者的足够重视，而提取高质量的表皮葡萄球菌总RNA，是进行一系列后续基础实验如实时荧光定量PCR分析、cDNA文库的合成、微阵列基因差异表达分析等的先决条件[4]。目前，关于革兰氏阳性细菌总RNA提取的商业化试剂盒很多，但这些试剂盒难以满足不同种属细菌尤其是表皮葡萄球菌总RNA的抽提要求，实验过程中提取的表皮葡萄球菌细胞RNA总量少、品质低，在菌体生长的各阶段特别是菌体对数生长早期，通常需要大量培养菌体以用于总RNA的制备。因此，建立快速、高效、高质量表皮葡萄球菌总RNA提取方法可为该菌的相关研究提供便利。

表皮葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌，其细胞壁层较厚，含有致密的肽聚糖层，因而其细胞壁难破裂，是导致其细胞总RNA提取总量少、品质低的主要原因。而选择合适的方法，促进细胞壁的完全破裂成为提取表皮葡萄球菌总RNA的关键步骤。因此，本文以表皮葡萄球菌ATCC35984为实验材料，采用单酶酶解、双酶酶解、液氮研磨等方法破碎细胞壁，以商业化的Trizol试剂盒法做对照，比较这4种细胞壁破碎方法对表皮葡萄球菌细胞总RNA抽提效果的影响，为后续的表皮葡萄球菌分子生物学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

表皮葡萄球菌标准菌株ATCC35984(强产膜株)，购于中国食品药品检定研究院。

1.2 主要试剂和仪器

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB，杭州微生物试剂有限公司)；溶菌酶(北京索莱宝科技有限公司)；溶葡萄球菌酶(上海生工生物工程股份有限公司)；Trizol(上海生工生物工程股份有限公司)；研磨珠(法国Bertin Technologies公司)；DNaseⅠ(宝生物工程有限公司)；RNA反转录试剂盒(宝生物工程有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。

紫外可见分光光度计(上海龙尼科仪器有限公司)；核酸电泳系统(上海伯乐生命医学产品有限公司)；凝胶成像系统 Tanon-1600(上海天能科技有限公司)；PCR仪(德国艾本德股份公司)；恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(日立公司)；OneDrop微量紫外分光光度计(南京五义科技有限公司)；Precellys 24多功能样品均质器(法国Bertin Technologies公司)；QuantStudio TM 6 FlexqRT-PCR仪(美国赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基和缓冲液

胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB(g/L)：胰蛋白胨17.0，植物蛋白胨3.0，氯化钠5.0，磷酸氢二钾2.5，葡萄糖2.5，pH 7.3±0.2，1×105Pa灭菌15 min。TSB固体培养基在以上培养基中加入琼脂粉15.0 g灭菌制备。

TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

变性液：4 mol/L 硫氰酸胍，25 mol/L 柠檬酸钠·2H2O，0.5%(m/V)月桂基肌酸钠，0.1 mol/L β-巯基乙醇，现配现用，每次使用前加入7.2 μL β-巯基乙醇/1 mL变性液。

1.3.2 表皮葡萄球菌的培养及菌体制备

在超净工作台，用接种环蘸取保存于-70℃的表皮葡萄糖球菌菌液，直接在TSB固体培养基平板上划线，37℃条件下培养12 h后，挑取单克隆于5 mL新鲜TSB液体培养基，继续于37℃、150 r/min条件下培养至菌体密度OD600=1.6时，分别收集1 mL或8 mL(用于液氮研磨法)菌液备用。

收集的菌液在8000 r/min、4℃条件下离心1 min后收集菌体，并用500 μL含DEPC的无菌水漂洗1次，10 000 r/min离心1 min后再次收集菌体并重悬于100 μL TE缓冲液中备用。

1.3.3 细胞壁裂解及总RNA的抽提

收集并重悬于100 μL TE缓冲液中的表皮葡萄糖球菌菌体按照以下4种方法处理：1)Trizol试剂裂解联用研磨珠破碎法。向样品中加入1 mL Trizol；称取0.3 g Glass Beads 放入专用Ep管中，同时将样品转移至专用Ep管中，静置5 min，待充分裂解；使用Precellys 24多功能样品均质器高速匀浆15～30 s。2)单酶酶解。加入溶菌酶(终浓度3 mg/mL)，室温孵育15 min。3)双酶酶解。加入溶葡萄球菌酶(终浓度100 μg/mL)和溶菌酶(终浓度100 μg/mL)，涡旋震荡1 min，37℃孵育10 min。4)液氮研磨。将重悬于100 μL TE缓冲液中的表皮葡萄糖球菌菌体转移至10 mL Ep管中，加液氮适量并使用直径0.5 cm的研棒研磨菌体至粉末状。

后续实验中，向上述方法1)加入200 μL氯仿，涡旋震荡15 s，静置5 min，4℃、12 000 r/min离心10 min使溶液分层；RNA溶于上层水相中，小心吸取上层水相(约600 μL)至另一新的离心管，加入等体积的预冷异丙醇，静置10 min；4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL预冷的75%乙醇洗涤沉淀，4℃、12 000 r/min离心3 min，弃上清，将样品静置于超净工作台内吹干；加入30～50 μL RNase-Free无菌水溶解RNA，-70℃保存。

将上述方法2)～4)中溶液及沉淀转入新的离心管中，加入1 mL变性液；加入100 μL 2 mol/L的醋酸钠，1 mL酚，200 μL氯仿-异丙醇，涡旋震荡10 s，冰上放置15 min；4℃、12 000 r/min离心10 min使溶液分层；小心吸取上层水相至另一新的离心管，加入等体积的预冷异丙醇；4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入1 mL预冷的75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、12 000 r/min离心3 min，弃上清；待乙醇挥发干净后，加入40 μL RNase-Free无菌水溶解沉淀；加入10 μLDNaseⅠ反应液(含RecombinantDNaseⅠ 10 U、RNaseInhibitor 20 U、5 μL 10×DNaseⅠ Buffer)；混匀后在37℃条件下反应30 min，将溶液转移至新的离心管中，加入1 mL变性液，再进行一轮抽提；待RNA样品吹干后加30～50 μL RNase-free无菌水溶解RNA，-70℃保存。

1.3.4 总RNA的质量及完整性检测

所提总RNA的纯度采用One Drop微量分光光度计对其吸光值及浓度进行测定，分别记录260 nm、230 nm、280 nm处的OD值，并计算OD260/OD280及OD260/OD230。根据所测的浓度，取相同含量的RNA于1.0 %的变性琼脂糖凝胶上150 V稳压电泳6～10 min，取出EB染色 6～10 min，在凝胶成像系统中观察成像。

1.3.5 cDNA第一条链的合成及管家基因gryB的扩增

反转录按照宝生物(大连)有限公司的反转录试剂盒说明书进行反转录反应，合成表皮葡萄球菌的cDNA第一链。取表皮葡萄球菌cDNA进行PCR，PCR扩增表皮葡萄球菌gryB片段。引物(上游引物5′-AGCGGTTCGTAAAAGACCGGGTATG-3′，下游引物5′-CCTGCTAATGCCTCGTCAATAC-3′)，cDNA模板经94℃变性7 min，按照94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 15 s程序扩增28个循环，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 不同方法提取RNA完整性

琼脂糖凝胶电泳是检测RNA质量和完整性的重要方法[5]，图1为4种实验方法抽提总RNA的检测结果。Trizol裂解联用研磨珠破碎法提取的RNA完整性较差，只有一条带可见；单酶酶解法未能提取出表皮葡萄球菌的RNA；双酶酶解法提取的RNA，23S和16S条带清晰可见。液氮研磨法可以得到完整的RNA，23S和16S条带清晰可见且无降解，23S带接近于16S带亮度的两倍，没有拖尾现象，说明得到了很好质量的RNA样品。

图1 不同方法提取表皮葡萄球菌总RNA的电泳图

A：Trizol裂解联用研磨珠破碎法；B：单酶酶解法；C：双酶酶解法；D：液氮研磨法

2.2 不同提取方法抽提总RNA的纯度和浓度

测定不同方法获得RNA样品的OD230、OD260和OD280，双酶酶解法以及液氮研磨法提取表皮葡萄球菌总RNA的OD260/OD280分别为2.06±0.18和1.98±0.05；OD260/OD230分别为2.13±0.07和2.22±0.13(表1)。双酶酶解法和液氮研磨法所提取RNA纯度较高，并有效除去了蛋白、多糖、酚类物质，可以用于后续实验。但后者提取的RNA浓度均显著优于前者。

表1 4种不同总RNA提取方法对表皮葡萄球菌提取效果的比较

2.3 表皮葡萄球菌RNA样品的cDNA合成及质量

将表皮葡萄球菌总RNA反转录成cDNA，并以其为模板进行扩增gryB片段，进一步检测所提取的RNA的质量。电泳结果显示，双酶酶解法与液氮研磨法均可得到100 bp左右的带，与预期结果(108 bp)一致(图2)。这说明所提取的RNA具有较强的反转录活性，能够更好满足后续实验要求。

图 2 RT-PCR扩增gryB的部分序列

M：low MW DNA Marker-A；1：双酶酶解法样品扩增产物；2：液氮研磨法扩增产物

3 结论

表皮葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，其细胞壁是由厚且致密的肽聚糖和磷壁酸组成，而肽聚糖的肽链通过5个甘氨酸互相交联，不易裂解[7]，一般温和的破壁方法很难将其完全破碎；同时，相对于动植物等真核细胞而言，细菌细胞的RNA含量少，半衰期很短，很容易降解[6]。因此，细胞壁的有效裂解是提取高质量表皮葡萄球菌总RNA的关键。目前，在细菌总RNA提取的商业化试剂盒中，所提到细胞壁裂解方法大多数是使用单酶(溶菌酶，终浓度3 mg/mL)室温酶解法，但是，我们前期实验表明，这些试剂盒采用的方法并不适用于表皮葡萄球菌。

本研究中，我们选择采用双酶酶解和物理法(液氮研磨)两种方法破碎细胞壁。采用溶菌酶(终浓度100 μg/mL)和溶葡萄球菌酶(终浓度100 μg/mL)在37℃(酶的最适温度)条件下孵育15 min，能顺利提取表皮葡萄球菌的RNA。双酶解法和液氮研磨法得到的RNA均能够进行反转录并顺利扩增出管家基因，可以用于后续的分子生物学实验。但是，这两种方法也存在自身的优点和不足。例如，溶葡萄球菌酶价格较为昂贵，且酶与细胞的孵育会影响RNA的质量[8]；液氮研磨法经济快速，可充分破碎细胞壁，RNA电泳检测结果显示也可得到清晰的RNA条带，但因抽提研磨过程中为方便操作，使用的样品的量一般为双酶法提取所需量的5倍以上。Trizol试剂盒是市场上常见的试剂盒之一，研磨珠破碎联用Trizol试剂盒法是革兰氏阳性细菌及真菌总RNA提取较为成熟的方法之一[9-10]，本研究中该方法没有提取到RNA，其具体原因尚不清楚，可在之后的工作中继续优化实验条件。

总之，本研究通过比较几种表皮葡萄球菌RNA的提取方法，建立了可以获得高质量RNA的实验方法，为后续表皮葡萄球菌分子生物学研究奠定了基础。

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ComparisonofmethodsfortotalRNAextractionfromStaphylococcusepidermidis

XU Gan-fei1, GUAN Yan2

(1. School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601; 2. Clinical College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

The efficiency and quality of extracted total RNA play a key role in molecular biology research.Staphylococcusepidermidis, a gram-positive bacterium, possesses thick cell wall, which is hard to rupture and difficult to extract its total RNA. In this study, different strategies including single enzyme disruption, combined enzyme disruption etc. were compared in order to obtain an efficient and stable method for total RNA extraction fromS.epidermidisATCC35984. Results showed that the total RNA extracted by liquid nitrogen grinding or combined enzyme disruption exhibited relatively better integrity, purity and repeatability.

Staphylococcusepidermidis; total RNA; extraction method

2016-10-25；

2016-11-02

安徽省自然科学基金项目(No.1508085MH200)；安徽省教育厅自然科学研究项目(No.KJ2013Z163)

许甘霏，博士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学相关研究, E-mail:xuganfei_ahu@163.com

官 妍，教授，从事细菌、真菌生物被膜方向的研究，E-mail:guanyan0726@sina.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.097

Q933

B

2095-1736(2017)06-0097-04