邹立军， 龚 婧， 黄 文， 庄远红， 廖海艳， 吉 璐

(湖南第一师范学院 基础生物学实验室， 长沙 410205)

JNK抑制剂SP600125对金鱼胚胎发育及JNK1表达的影响

邹立军， 龚 婧， 黄 文， 庄远红， 廖海艳， 吉 璐

(湖南第一师范学院 基础生物学实验室， 长沙 410205)

为探明JNK信号通路在鱼类胚胎发育过程中的作用，通过使用JNK信号特异性抑制剂SP600125对金鱼胚胎进行浸泡处理，采用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测JNK1 mRNA和蛋白在胚胎不同发育时期的表达。结果显示：从受精卵发育至原肠胚期后，SP600125能够显著阻滞胚胎的发育时间，同时伴随大脑、眼睛、心脏和体节等组织器官的发育迟缓并出现畸形。qPCR检测结果显示JNK1在实验组和对照组中的表达模式没有明显变化，均表现为“升高-降低-升高-降低”的趋势。Western Blotting检测结果显示JNK1蛋白的表达在对照组中的表达模式与mRNA的表达水平吻合，而实验组中，胚胎发育至原肠胚后JNK1蛋白持续保持较低水平的增加。研究表明，JNK信号通路在鱼类胚胎发育和组织器官发生及发育过程中发挥了重要作用。

JNK1；SP600125；胚胎发育；金鱼；器官发生

SP600125 又称为Anthrapyrazolone(吡唑蒽酮)或1,9-Pyrazoloanthrone(1,9-吡唑并蒽酮)，是一种广泛使用的JNK高选择性小分子抑制剂；其作用机制为与ATP 相互竞争来获取 JNK 上相关结合位点而抑制 JNK活性[12]。本实验室通过分子克隆技术获得了JNK1全长并发现其在金鱼的性腺发育不同时期表达存在显著差异[13]，因此推测JNK1可能在金鱼组织器官的形成和发育过程中发挥重要作用。本研究利用SP600125浸泡处理金鱼受精卵，通过荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测了JNK1 mRNA和蛋白在胚胎发育过程中的表达模式，为初步探讨JNK信号通路对鱼类胚胎发育以及器官形成的影响提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料采集

取本实验室养殖金鱼，在繁殖季节采用人工授精的方法使鱼卵在水中受精。在受精卵发育过程中，根据显微镜下观察到的发育特征，分别收集不同发育阶段的胚胎，包括两细胞期、多细胞期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、视原基期、肌肉效应期、色素期和出膜期等9个发育时期的胚胎，用液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要试剂

总RNA提取试剂盒RNAiso Plus和反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；JNK抑制剂SP600125(Merck-Millipore，美国)；SYBR®Select Master Mix，蛋白酶抑制剂Cocktail，PageRulerTMPrestained Protein Ladder和NBT/BICP 显色剂(Thermo Scientific，美国)；兔抗JNK1单克隆抗体，鼠抗β-actin单克隆抗体和IgG-AP二抗(Santa Cruz，美国)；DNA Ladder，RIPA裂解液，Bradford蛋白浓度测定试剂盒和SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天，中国)；JNK1和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要仪器

徕卡DM3000生物显微镜和CH-9435 CCD摄像头(Leica, 瑞士)； NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo Scientific，美国)；Microfuge®20R Centrifuge 台式温控离心机(Beckman，美国)；凝胶电泳槽(北京六一，中国)；GDS7500 凝胶成像系统(UVP，美国)；ABI Veriti®PCR仪和ABI 7500 HT platform实时定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)；蛋白电泳Mini-PROTEAN Tetra系统(BioRad，美国)；Primer 5.0引物设计软件；Gel-Pro图像分析软件和SPSS 19.0软件。

1.2 方法

1.2.1 SP600125处理胚胎

据统计，2018年云南大学的在校留学生共923人，在“一带一路”五周年之际，留学生数量相比2013年增加了70%[37]。本研究选取云南大学校本部的留学生为研究对象。据实地调查，云南大学校本部的留学生生源主要来自于东南亚、南亚、东亚及欧美各国，以东南亚、南亚国家为主。留学生多为本科生、语言班学生，近年来，研究生、博士生的比例有所提高。

JNK抑制剂SP600125粉末用二甲基亚砜(DMSO)配制并分装，贮存于-80℃冰箱备用。预实验中，使用不同的JNK抑制剂浓度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 μm)处理金鱼受精卵，结果显示抑制剂浓度太低对胚胎发育没有影响，而浓度太高则导致胚胎在早期就出现大量死亡。基于预实验的结果，选取2.0 μm的SP600125对约2000颗受精卵进行浸泡处理(实验组)；曝气水中自然发育则设置为对照组；且每6 h更换一次抑制剂和曝气水，始终保持抑制剂浓度为2.0 μm。在高倍显微镜下每隔10 min间断观察胚胎变化，同时记录室温、距离受精时长以及发育进程。

1.2.2 总RNA提取及cDNA 第一条链合成

取金鱼各发育时期胚胎约20颗加入一定量的液氮充分研磨后参照RNAiso Plust说明书提取总RNA，随后用1%的琼脂糖凝胶电泳验证各组织RNA片段的完整性。用超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度；检测结果较好的总RNA(1.8

1.2.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)

采用Quantitative Real-time PCR(qPCR)检测JNK1(β-actin作内参)在金鱼胚胎发育过程中的mRNA表达水平。qPCR反应体系为：5 μL SYBR Mix，0.3 μL正向/反向基因特异引物(JNK1正向引物：5′-GAATAAGCGTGAGAAGGA-3′，反向引物 5′-AAGGGTCGGCTAAGTTTC-3′；β-actin正向引物：5′-GTGACCCACACTGTACCCA-3′，反向引物：5′-TCCAGAGAGGAAGAGGAGGC-3′)，1 μL cDNA 第一条链及3.4 μL RNase-free H2O，总体系为10 μL。反应条件为：50℃预变性2 min；95℃变性10 min，95℃退火15 s，60℃延伸45 s，40 个循环。熔解曲线程序，95℃，60 s；60℃，60 s，从60℃开始上升至95℃获得熔解曲线；每个样品均进行3次重复测定。根据不同样本的扩增曲线，确定扩增循环数(Ct值)，参照Livak等[14]提出的相对标准曲线法计算mRNA相对表达量R=2-ΔΔCt(目的基因-内参基因)，并对相对定量的结果进行分析。

1.2.4 蛋白免疫印迹(Western Blotting)

取金鱼各发育时期胚胎约40颗用少量液氮研磨至粉末状，再加入含蛋白酶抑制剂的蛋白抽提液，12 000 r/min 4℃离心20 min，取上清，利用Bradford法测定总蛋白浓度，随后蛋白分装保存于-80℃冰箱。Western Blotting各个步骤均按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒标准流程进行操作(蛋白上样量均为50 μg)。一抗稀释浓度为：兔抗JNK单克隆抗体(200 g/L，1∶2000)，鼠抗β-actin单克隆抗体(200 g/L，1∶10 000)；二抗稀释浓度为：抗兔或抗鼠的碱性磷酸酶偶联的IgG二抗(1∶10 000)。显影结果采用Gel-Pro软件分析获得JNK1和β-actin的灰度值，通过计算JNK1/β-actin获得蛋白相对表达数值。

1.2.5 数据分析

2 结果

2.1 JNK抑制剂对金鱼胚胎发育影响

JNK抑制剂处理的金鱼胚胎在发育进程上较对照组有明显滞后的现象，实验组的胚胎出膜时间较对照组推迟约18 h。其中，在受精完成至原肠胚期的发育时间和正常发育时间基本一致；从原肠胚发育开始，抑制剂处理的胚胎发育时间要明显放缓(表1)，并出现胚胎大量死亡的现象。存活下来的胚胎继续发育，与对照组比较，呈现体长变短，卵黄囊吸收不均匀，且都出现大脑、眼睛、心脏和体节等组织器官发育畸形(图1)。

2.2 JNK1 mRNA在金鱼胚胎发育过程中的表达水平

采用qPCR对JNK1 mRNA在金鱼胚胎(对照组和实验组)不同发育时期的表达进行分析。反应结束后，ABI 7500 HT platform系统显示JNK1和β-actin引物的熔解曲线分别为特异性单峰，表明qPCR扩增的是目的产物，引物设计符合实验标准和要求。随后的数据分析结果显示，JNK1在金鱼9个胚胎发育中均被检测到有一定的表达，且呈“升高-降低-升高-降低”的波动表达趋势，且在肌肉效应期表达量最高(P<0.05)，具体见图2。在实验组中，JNK1 mRNA 水平的表达模式和对照组中的趋势基本一致。

表1 金鱼胚胎对照组和实验组发育时间

图1 SP600125抑制JNK信号通路对金鱼胚胎发育的影响
Fig 1 Effect of JNK inhibition on the embryo of goldfish

A～C：SP600125处理组，分别为原肠胚期、色素期和出膜期；D～E：对照组，分别为原肠胚期、色素期和出膜期

2.3 JNK1蛋白在金鱼胚胎发育过程中的表达水平

通过Western Blotting技术检测了JNK1在金鱼胚胎不同发育时期的表达模式，结果显示，JNK1在胚胎正常发育过程中的表达呈“降低-升高-降低”的趋势(图3-A、C)，其中在视原基期的表达量最高(P<0.05)，在两细胞期、神经胚期和肌肉效应期的表达水平较高，而出膜期的表达量最低。实验组中，JNK1的表达也呈现明显的波动趋势，其中在两细胞期和色素期的表达量较高，胚胎发育至原肠胚后JNK1持续保持较低水平的增加；且原肠胚期、神经胚期、视原基期和肌肉效应期的相对表达丰度低于对照组(图3-B、C)。

图2 JNK1在金鱼胚胎不同发育时期的mRNA表达水平Fig 2 Expression level of JNK1 mRNA in in different developmental phases of embryo in control group and experimental group

1：两细胞期；2：多细胞期；3：囊胚期；4：原肠期；5：神经胚期；6：视原基期；7：肌肉效应期；8：色素期；9：出膜期。数据均表示为平均数±标准误(n=3)，图中标有不同的字母表示存在显著性差异(P<0.05)

图3 JNK1在对照组(A)和实验组(B)胚胎不同发育时期的蛋白表达水平以及蛋白丰度柱形图(C)Fig 3 Protein expression level of JNK1 in different developmental phases of embryo in control group (A) and experimental group (B) and protein abundance column chart (C)

1：两细胞期；2：多细胞期；3：囊胚期；4：原肠期；5：神经胚期；6：视原基期；7：肌肉效应期；8：色素期；9：出膜期。 数据均表示为平均数±标准误(n=3)，图中标有不同的字母表示存在显著性差异(P<0.05)

3 讨论

JNK是高等动物体内广泛存在的一类Ser/Thr蛋白激酶，自1993年Hibi等[15]发现JNK至今，对于其在细胞增殖、分化和凋亡过程中的作用机制及调控方式等方面的研究取得了一系列成果。JNK 信号转导是通过蛋白激酶间的酶促磷酸化级联反应实现的，可以简单概括为MAPK激酶(MAPK kinase kinases,MAP3Ks)→ MAPK激酶(MAPK kinases, MAP2Ks)→ JNK→ 转录因子(c-Jun等)[16]。

大量的研究证实，MPAK/JNK信号通路能够对生长因子、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)等细胞因子[17]，紫外辐射、热激等多种环境刺激产生应答，从而参与调节细胞增殖、运动、凋亡以及DNA损伤修复等多种生理生化反应。JNK 作为细胞由正常状态向病理状态转变过程中的一个重要的调节激酶；其功能与神经退行性疾病、慢性炎症、出生缺陷、癌症等多种疾病的发生直接相关[18]。细胞的增殖方式主要是通过有丝分裂进行的，而JNK激酶对有丝分裂过程中的细胞周期具有重要的调控作用[16, 19]。一系列研究证明JNK抑制剂SP600125能够抑制诱导癌细胞凋亡并使癌细胞阻滞于G2/M时期[20-22]。在本研究中，JNK抑制剂处理的金鱼胚胎发育至原肠胚时期后，与对照组相比，发育缓慢，并发生胚胎的大量死亡，推测可能是抑制JNK活性后细胞周期阻滞并诱导细胞产生凋亡所致。Huang等[23]通过显微注射将JNK的显性突变体(DNM-JNK)转染至金鱼的受精卵进而抑制JNK活性，结果导致金鱼胚胎死亡率显著增加，同时引起多种器官(眼睛、神经管以及肌肉)出现畸形。He等[12]通过SP600125处理斑马鱼胚胎后发现胚胎大量死亡，进一步分析发现JNK抑制剂处理后神经丘细胞在分裂过程中出现缺陷并伴随caspase-3大量表达，表明SP600125能显著诱导神经细胞的凋亡。本研究中，JNK抑制剂处理的金鱼胚胎在发育过程中出现大脑、眼睛、心脏和体节等组织器官畸形，推测可能由于JNK活性受抑制进而诱导上述组织发生细胞凋亡所致；表明JNK信号通路在组织器官的发生和发育过程中发挥了重要作用。Chambon等[24]研究发现JNK信号的适时激活是海鞘(ascidian)蝌蚪幼体尾部细胞发生凋亡所必需的，从而引起尾巴发生退化；随后通过SP600125处理早期海鞘蝌蚪幼体后，发现能够抑制其尾部细胞的凋亡，进而完全阻断尾部退化及变态过程。Rana等[25]通过RNA干扰敲降了精子相关抗原9基因(sperm-associate antigen 9，SPAG9)后发现其与JNK激酶存在相互作用的结构同源性，表明JNK可能参与生殖细胞的分化调控。最新的研究证明SP600125能够通过P53信号通路诱导鱼类细胞的体外多倍体化[26]。

本研究中，通过qPCR检测发现，JNK1在胚胎发育过程中对照组和实验组的mRNA表达模式基本一致，表明JNK抑制剂对于JNK1的影响不是发生在转录水平。在蛋白水平，对照组中JNK1在视原基时期蛋白表达量较高，采用JNK抑制处理后，JNK1的表达趋势发生变化，原肠胚时期以后(除色素期)相对表达丰度低于对照组；随着胚胎发育的进程出现胚胎大量死亡并出现组织器官(大脑、眼睛、心脏和体节等)畸形。这些结果说明JNK信号通路在金鱼胚胎发育及器官形成的过程中具有重要的调节作用；但是对于JNK1作为一个独立的调节基因来调控胚胎发育的机制还有待于进一步研究。

[1]WESTON C R, DAVIS R J. The JNK signal transduction pathway [J]. Curr Opin Cell Biol, 2007, 19(2): 142-149.

[2]RAMAN M, CHEN W, COBB M H. Differential regulation and properties of MAPKs [J]. Oncogene, 2007, 26(22): 3100-3112.

[3]LIU J, LIN A. Role of JNK activation in apoptosis: a double-edged sword [J]. Cell Res, 2005, 15(1): 36-42.

[4]GUPTA S, BARRETT T, WHITMARSH A J, et al. Selective interaction of JNK protein kinase isoforms with transcription factors [J]. EMBO J, 1996, 15(11): 2760-2770.

[5]陈丽莉, 邹立军, 熊 振, 等.jnk3基因在金鱼和斑马鱼不同发育时期胚胎与成体不同组织中的分化表达 [J]. 水产学报, 2011, 35(2): 161-169.

[6]KUMAGAE Y, ZHANG Y, KIM O J, et al. Human c-Jun N-terminal kinase expression and activation in the nervous system [J]. Brain Res Mol Brain Res, 1999, 67(1): 10-17.

[7]KYRIAKIS J M, AVRUCH J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation [J]. Physiol Rev, 2001, 81(2): 807-869.

[8]PEARSON G, ROBINSON F, BEERS G T, et al. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions [J]. Endocr Rev, 2001, 22(2): 153-183.

[9]PULVERER B J, KYRIAKIS J M, AVRUCH J, et al. Phosphorylation of c-jun mediated by MAP kinases [J]. Nature, 1991, 353(6345): 670-674.

[10]CARGNELLO M, ROUX P P. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases [J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2011, 75(1): 50-83.

[11]OWENS D M,KEYSE S M. Differential regulation of MAP kinase signalling by dual-specificity protein phosphatases [J]. Oncogene, 2007, 26(22): 3203-3213.

[12]HE Y, CAI C, SUN S, et al. Effect of JNK inhibitor SP600125 on hair cell regeneration in zebrafish (Danio rerio) larvae [J]. Oncotarget, 2016, 7(32) : 51640-51650.

[13]邹立军, 陈丽莉, 龚 婧, 等. 金鱼JNK1基因的克隆及表达研究 [J]. 生命科学研究, 2013, 17(4) : 292-297.

[14]LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method [J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[15]HIBI M, LIN A, SMEAL T, et al. Identification of an oncoprotein-and UV-responsive protein kinase that binds and potentiates the c-Jun activation domain [J]. Genes Dev, 1993, 7(11): 2135-2148.

[16]DAVIS R J. Signal transduction by the JNK group of MAP kinases [J]. Cell, 2000, 103(2): 239-252.

[17]SABIO G, DAVIS R J. TNF and MAP kinase signalling pathways [J]. Semin Immunol, 2014, 26(3): 237-245.

[18]YAN D, AN G, KUO M T. C-Jun N-terminal kinase signalling pathway in response to cisplatin [J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(11): 2013-2019.

[19]LIN A. Activation of the JNK signaling pathway: breaking the brake on apoptosis [J]. Bioessays, 2003, 25(1): 17-24.

[20]HILLS F A, ABRAHAMS V M, GONZALEZ-TIMON B, et al. Heparin prevents programmed cell death in human trophoblast [J]. Mol Hum Reprod, 2006, 12(4): 237-243.

[21]DU L, LYLE C S, OBEY T B, et al. Inhibition of cell proliferation and cell cycle progression by specific inhibition of basal JNK activity: evidence that mitotic Bcl-2 phosphorylation is JNK-independent [J]. J Biol Chem, 2004, 279(12): 11957-11966.

[22]MINGO-SION A M, MARIETTA P M, KOLLER E, et al. Inhibition of JNK reduces G2/M transit independent of p53, leading to endoreduplication, decreased proliferation, and apoptosis in breast cancer cells [J]. Oncogene, 2004, 23(2): 596-604.

[23]HUANG X Q, HUANG Z X, LI Z L, et al. C-Jun terminal kinases play an important role in regulating embryonic survival and eye development in vertebrates [J]. Curr Mol Med, 2013, 13(1): 228-237.

[24]CHAMBON J P, NAKAYAMA A, TAKAMURA K, et al. ERK- and JNK-signalling regulate gene networks that stimulate metamorphosis and apoptosis in tail tissues of ascidian tadpoles [J]. Development, 2007, 134(6): 1203-1219.

[25]RANA R, JAGADISH N, GARG M, et al. Small interference RNA-mediated knockdown of sperm associated antigen 9 having structural homology with c-Jun N-terminal kinase-interacting protein [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2006, 340(1): 158-164.

[26]ZHOU Y, WANG M, JIANG M, et al. Autotetraploid cell line induced by SP600125 from crucian carp and its developmental potentiality [J]. Sci Rep, 2016, 6: 21814.

EffectsofSP600125onembryonicdevelopmentandexpressionofJNK1ingoldfishCarassiusauratus

ZOU Li-jun, GONG Jing, HUANG Wen, ZHUANG Yuan-hong, LIAO Hai-yan, JI Lu

(Laboratory of Basic Biology, Hunan First Normal University, Changsha 410205, China)

The objective of this study was to explore the correlation of the c-Jun amino-terminal kinase (JNK) signaling pathway in the process of embryonic development of Goldfish (Carassiusauratus). SP600125, a JNK-specific inhibitor, gives rise to high mortality in goldfish; the expression of JNK1 was studied and analyzed in different developmental phases of embryo by using Quantitative Real-time PCR and Western Blotting. It was found that SP600125 could significantly block the embryo development time after gastrula stage. SP600125 is also responsible for the severe abnormality of organs, especially the brain, eyes, heart and skeletal system. The qPCR analysis revealed thatJNK1 appeared as "high-low-high-low"expression pattern during different stages of embryonic development in experimental group and control group. Western Blotting analysis showed that expression tendency of JNK1 protein was in line with that ofJNK1 mRNA in the control group. However, in the experimental group, JNK1 protein maintained a low level increase after gastrula stages compare to the control group. Together, these results suggested that JNK signaling pathway plays an important role in embryonic development and organogenesis of fish.

JNK1; SP600125; embryonic development; goldfish; organogenesis

2016-12-16；

2016-12-26

湖南省科技计划项目(2014FJ4261)；湖南省教育厅科学研究项目(14C0252)

邹立军，博士，讲师，从事动物发育中的信号传导机制研究, E-mail: zoulijun123@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.023

Q78

A

2095-1736(2017)06-0023-05