王 雨, 何盛南, 蔡志明, 牟丽莎

(1. 中山大学 医学院, 广州 510275； 2. 深圳市第二人民医院, 深圳 518035)

温度对微囊化重组CHO细胞生长和去氨普酶表达的影响

王 雨1,2, 何盛南1,2, 蔡志明2, 牟丽莎1,2

(1. 中山大学 医学院, 广州 510275； 2. 深圳市第二人民医院, 深圳 518035)

为了研究不同温度对微囊化rCHO细胞生长代谢和重组蛋白表达影响，采用不同温度培养微囊化rCHO细胞，经MTT法测定细胞生长曲线，生物传感器测定葡萄糖和乳酸代谢，纤溶平板测定去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator)蛋白表达量。结果表明，低温培养降低微囊化rCHO的增殖速率和细胞密度，但提高了重组蛋白的生产。可见温度显著影响微囊化rCHO的生长代谢和重组蛋白表达，33℃下可以将DSPA蛋白生产量最大提高41%。

微胶囊；温度；重组蛋白表达；细胞培养

去氨普酶(DSPA，Desmodus rotundus salivary plasminogen activator) 是一种从南美吸血蝙蝠唾液中提取的纤溶酶原激活剂，也是第3代溶栓药物[1]。与第1代和第2代溶栓药物，如tPA、uPA等相比，DSPA具有高度的溶栓能力，而且纤维蛋白特异性更高，不易引起出血性并发症[2-3]，目前已进入Ⅱ期临床试验。DSPA可通过重组技术在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中进行生产[4]，通过哺乳动物细胞生产蛋白药物也是生物制药的发展趋势[5]。哺乳动物细胞的大规模培养越来越多地采用无血清培养基，可以避免血清源性污染和有利于下游产品的纯化，但是同时也易造成细胞的凋亡，降低了细胞的蛋白表达能力。我国每年发生缺血性脑卒中的人口约有200万，临床治疗剂量巨大，如何高效地表达蛋白成为重要的研发环节。

从当前发展趋势来看，使用搅拌式生物反应器进行悬浮细胞的无血清培养是目前世界范围内各大生物公司产业化生产的发展方向。动物细胞无血清、悬浮培养在提高细胞密度、单位产量、简化生产工艺、降低生产成本、保证产品质量等方面都起到非常重要的作用，是高效生产最有效的途径。目前动物细胞规模化培养已经是世界各大生物公司竞相开发的前沿课题，美国FDA也要求各生物公司建立的规模化生产技术平台。同时由于大型生物反应器容量的过剩，国际上对动物细胞大规模培养的研究方向集中在培养工艺的优化。

我国的生物技术药物发展起步较晚，与国外相比，在哺乳动物细胞培养的上游技术方面，我国的基因重组技术水平低，构建的细胞系表达能力远低于国外。以tPA为例，我国的CHO表达能力仅是美国的1/10～1/5，提高细胞系的表达能力需要大量的资金和技术投入，短时间内极难完成。同时，我国的反应器容量小，如果盲目套用国外成熟的哺乳动物细胞大规模生产技术，就要相应扩大生产规模，从而将成本增加至5～10倍，这显然是极不现实的。因此，根据我国的现状优化动物细胞规模化培养技术是发展重组蛋白药物的必然要求。

重组蛋白的生产可以通过两个方面提高：细胞密度和细胞的蛋白表达能力。微囊化培养细胞技术是Lim和Sun提出的大规模培养技术[6]，利用聚赖氨酸-海藻酸钠-聚赖氨酸(APA)微囊将细胞包裹在半透膜中。微囊膜可防止细胞在培养过程中受到物理损伤，同时半透膜允许小分子影响物质自由通过被细胞利用。微囊为细胞提供了一个相对封闭的微环境，使细胞在囊内呈三维立体方式生长，有利于细胞间信息传递，提高重组细胞的产物表达能力[7]。在我们的前期研究中已经发现，与悬浮培养相比，微囊化培养可以将CHO的DSPA生产能力从32.5 μg/mL提高到95.5 μg/mL[8]。

细胞培养的环境温度是动物细胞大规模培养的重要优化指标。研究发现，培养温度的适当降低会使部分种类的细胞的生长代谢和蛋白表达发生变化。例如，培养温度降低时，杂交瘤细胞的生长代谢变缓，存活率提高，抗体的生产能力保持稳定[9-11]；重组BHK细胞的生长和代谢减缓，不影响重组抗凝血酶III的生产[12]；人胚胎肺细胞生产TPA的能力提高[13]。

优化重组CHO细胞的培养工艺对细胞的生长代谢及蛋白表达都是十分重要的。为了提高蛋白的容积产率，既要获得较高的细胞密度，又要提高细胞的蛋白表达能力。本实验中我们采用微囊化技术对表达DSPA蛋白的重组CHO细胞进行培养，并在细胞生长进入对数期时用不同温度对微囊化细胞进行处理，考察低温条件对细胞密度和蛋白表达的影响，以期对微囊化细胞培养工艺的优化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株及试剂：重组中国仓鼠卵巢细胞(recombinant China Hamster Ovary， rCHO)由山东齐鲁制药有限公司惠赠；培养基为CD OptiCHO(美国，Gibco公司)；谷氨酰胺(美国，Sigma公司)。聚赖氨酸(美国，Sigma公司)；海藻酸钠(青岛晶岩生物技术有限公司)；凝血酶原(美国，Sigma公司)；纤维蛋白原(美国，Sigma公司)；纤溶酶原(美国，Sigma公司)；MTT(美国，Sigma公司)。其他试剂均为国产分析纯。

主要仪器： MS-353酶联免疫检测仪(Labsystems Co. Ltd,芬兰)；Heraeus BB 16UV CO2恒温培养箱(Heal Force Development Co. Ltd,中国)；大功率高压脉冲微胶囊制备仪(本实验室研制)；微囊静电液滴发生器(本实验室研制)。

1. 2 实验方法和步骤

1.2.1 rCHO细胞的培养和计数 细胞生长到对数期后用台盼兰染色计算活细胞数量，接种到100 mL细胞培养瓶中，所用培养液为CD OptiCHO培养液(4 mmol/L谷氨酰胺)，接种密度为2×105/mL。每3天取上清于-20℃冰箱内保存，并用台盼兰染色计数活细胞数量。

1.2.2 微囊化rCHO细胞的制备[7]细胞生长到对数期后用台盼兰染色计算活细胞数量，悬于1.5%(W/V)海藻酸钠溶液中，细胞密度为2×106/mL。使用微囊静电液滴发生器将细胞-海藻酸钠混悬液滴入1.1%(W/V)的CaCl2溶液中钙化20 min形成海藻酸钙胶珠，然后依次用多聚赖氨酸成膜，用55 mmol/L柠檬酸钠溶液液化，获得包裹rCHO细胞的微胶囊。

1.2.3 微囊化rCHO细胞的培养 将制备好的微囊化rCHO细胞与培养基按体积比1∶10加入100 mL培养瓶中，分别在30℃、33℃和37℃，体积分数为5% CO2培养箱中培养，所用培养液为CD OptiCHO培养液(4 mmol/L谷氨酰胺)。每3天取上清于-20℃冰箱内保存，对细胞培养体系进行全换液。

1.2.4 微囊内活细胞密度测定 微囊内活细胞密度测量采用MTT法,MTT被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物数量与活细胞的数量成正比。将适量微囊加入24孔板，按10%体积加入MTT溶液，于37℃，5% CO2及饱和湿度条件下孵育24 h，使用DMSO溶解蓝色结晶后在酶标仪570/630 nm双波长下测定吸光度。根据吸光度OD值与微囊内活细胞做标准曲线,根据标准曲线计算细胞密度。

1.2.5 葡萄糖和乳酸代谢的测定 培养液中的葡萄糖和乳酸浓度采用SBA-40C型生物传感分析仪测定。

1.2.6 DSPA蛋白的测定 由Granelli等于1978年建立的检测PA物质的体外纤溶活性，模拟PA溶栓反应，溶圈直径与PA含量的对数线性相关，通过标准品形成溶圈梯度标准曲线估测PA含量，是定性和半定量检测PA的首选方法。根据文献报道制作纤维蛋白平板[14]，以生理盐水为溶剂配制0.5%琼脂糖凝胶，加入纤维蛋白原(0.529 U/mL)，凝血酶原(0.056 U/mL)，纤溶酶原(少量)，倒入水平放置的24孔板盖内凝固后打孔使用。向每孔内加入梯度浓度的DSPA标准品，测量溶圈直径，制作浓度直径标准曲线。向每孔内加入待测样品，测量溶圈直径，回归标准曲线可得到待测样品的DSPA浓度。

其中μp为DSPA比生产速率，μg/106cells/d；X为细胞密度，106/mL；△P为DSPA产量mg/L；t为培养时间，d；n代表时间点。

其中YX/G为细胞对营养物的得率系数，106/mg;△X为细胞增殖数量，106/mL；△G为葡萄糖消耗，mg/L。

其中YP/G为DSPA对营养物的得率系数，mg/mg; △P为DSPA产量，mg/L；△G为葡萄糖消耗量，mg/L。

其中YL/G为乳酸对营养物的得率系数，mg/mg; △L为乳酸生成量，mg/L；△G为葡萄糖消耗量，mg/L。

2 结果

2.1 微囊化培养对重组CHO细胞生长和DSPA表达的影响

图 1 不同培养方式下rCHO细胞的生长和DSPA生产曲线

为了考察微囊化培养对rCHO生长和蛋白表达的影响，本文考察了在不同培养条件下细胞的MTT活性，根据台盼兰计数及微囊化计数标准曲线，得到不同培养条件下微囊化rCHO细胞的生长曲线和DSPA表达曲线(图1-A和1-B)。从图1A中可以看出，不同培养条件下rCHO的生长趋势是一致的，在培养初期生长缓慢，培养一周左右后进入对数生长期。而微囊化细胞的对数增长期可以维持12 d，并且获得高密度的细胞数量，最大细胞密度为(3.86±0.09)×106/mL，是裸细胞最大密度的223%。在整个培养过程中，微囊化rCHO的DSPA蛋白产量一直高于裸细胞培养，在第15天两种培养方式都获得了最高产量，微囊化培养的最高产量为(41.48±1.01)mg/L,比裸细胞的最高产量提高了72%(图1-B)。比生成速率(μp)的物理意义是单位时间内单位数量的rCHO的DSPA产量，表征了单细胞的重组蛋白生产能力。从图1-C可以看出，微囊化培养促进了rCHO细胞的DSPA生产能力，最大生产能力为(7.68±0.19)μg/106cells/d，比裸细胞培养提高了59%。微囊化培养不但提高了rCHO的细胞密度，而且促进了细胞的蛋白生产能力，从而增加了培养体系的DSPA产量。

2.2 温度对微囊化rCHO细胞生长的影响

图 2 温度对微囊化rCHO细胞生长的影响

在微囊化细胞进入对数生长期时采用不同的培养温度，结果显示在继续培养过程中，在低温条件(30℃)下，细胞数量减少，比生长速率为负。在较低温度(33℃)下，rCHO细胞的生长速度减慢，最大密度为(3.06±0.07)×106/mL，是37℃培养温度下最大细胞密度的79%，二者的比生长速率无显著性差异。但同时低温也延长了细胞维持最大密度的时间，并且在37℃下细胞密度下降的培养后期，仍然保持了较高的细胞密度(图2)。尽可能延长高密度细胞的生长时间，是获得蛋白高产量的途径之一。

2.3 温度对微囊化rCHO细胞蛋白表达的影响

为了考察微囊化rCHO细胞在不同温度下的蛋白表达，使用纤溶平板法测定培养体系中DSPA的浓度即容积产率，结果如图3。低温条件(30℃)下，微囊化rCHO的蛋白表达能力持续下降。从图3-A中可知，33℃下微囊化rCHO细胞的DSPA生产量与37℃相比，细胞的数量减少，但是蛋白表达量反而增加。最大值分别可达(48.43±0.88)mg/L和(41.48±1.01)mg/L，低温培养的DSPA最大表达量是37℃的117%。对于DSPA比生产速率的比较(图3-B)表明，33℃下，微囊化rCHO细胞的DSPA生产能力比37℃下最大提高了41%，并且在进入对数生长期后的一周内保持较高的蛋白表达活性。

图 4 温度对微囊化rCHO细胞代谢的影响Fig 4 The effect of temperature on the metabolism of microencapsulated rCHO cells

2.4 温度对微囊化rCHO细胞代谢的影响

微囊化rCHO细胞的葡萄糖及乳酸代谢由生物传感器测得，结果见图4。在培养温度由37℃降至33℃时，微囊化rCHO细胞的葡萄糖消耗和乳酸生成随着温度降低而减少，说明随着培养温度的降低，葡萄糖代谢速率降低。结合图2进行分析，在温度从37℃降低到33℃的前3天培养时间，微囊化rCHO细胞几乎没有增殖，对葡萄糖的摄取出现明显减少，但乳酸生成量增加，说明在低温培养初期，微囊化rCHO的葡萄糖代谢更多地进入糖酵解途径。分析原因在于，培养温度的骤然下降，线粒体对有氧代谢功能减弱，而经过短暂适应过程后，微胶囊微环境帮助囊内拮抗环境变化，使细胞对葡萄糖的利用恢复到初始水平，但整体仍低于较高温度下。同时，随着温度的降低，细胞对葡萄糖的得率升高，乳酸对葡萄糖的得率降低，产物对葡萄糖的得率显著增加，结果见图5。说明随着温度降低，葡萄糖用于无氧呼吸的比例降低，用于细胞增殖和DSPA蛋白生产的葡萄糖比例增加。在温度对杂交瘤细胞影响的研究中也发现了相似的规律[15]。结合图2～5，可以发现，在低温条件下(30℃)，微囊化CHO细胞数量，代谢及蛋白生产能力均下降，不适合进行培养。

3 讨论

目前的研究表明：微囊化培养和低温培养都有利于重组细胞的蛋白表达。为了获得最大的重组蛋白产量，一方面要尽可能提高细胞密度，另一方面要保持细胞的蛋白表达能力。

图 5 温度对微囊化rCHO细胞的细胞得率、产物得率和乳酸得率的影响

本研究发现，微囊化rCHO细胞可以提高DSPA蛋白的产量，原因在于微囊化培养为细胞提供了三维生长环境，不仅提高了细胞密度，而且促进了单位细胞生产DSPA蛋白的能力，所以微囊化培养提高了生产体系的DSPA产量。但微囊化细胞的增殖和蛋白表达存在负相关，当细胞增殖过快时，营养物质过多用于细胞自身蛋白的合成，重组蛋白的表达受到影响，并非细胞密度越大，所能获得的重组蛋白的产量越高[16]。

适当降低温度减缓了细胞生长，使最大细胞密度降低，延长了细胞生长的延滞期，细胞增殖较快时，更多细胞进入细胞周期的G1期，而处于表达重组蛋白的G0期的细胞数量少直接导致重组蛋白产量低[17-18]。低温培养增加了杂交瘤细胞的G1期比例[19]，提高了单克隆抗体的生产[15]。Kaufmann在CHO细胞的低温培养中发现，温度降低诱导了RNA结合蛋白CIRP的过量表达，从而抑制细胞生长停留在细胞周期的G1期[20]，温度降低也会延迟细胞的凋亡[21]。低温培养降低了细胞对葡萄糖的代谢能力和乳酸对葡萄糖的得率，提高了细胞和DSPA蛋白对葡萄糖的得率，说明低温条件下葡萄糖更多的用于细胞增殖和DSPA蛋白的合成，因而重组蛋白的表达活性较高。

本文着重研究了不同温度对微囊化rCHO细胞的生长代谢及蛋白表达能力的影响。结果表明，随着温度适当降低，微囊化rCHO的细胞密度降低，但是蛋白表达能力并不随着温度降低而提高，从而提高蛋白生产量。该结果对微囊化培养rCHO细胞生产重组蛋白的工艺优化提供了一定的依据。

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EffectsoftemperatureonmicroencapsulatedrecombinantCHOcellsproliferationandDSPAproduction

WANG Yu1, 2, HE Sheng-nan1, 2, CAI Zhi-ming2, MOU Li-sha1, 2

(1. Medicine School， Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275; 2. Shenzhen Second People′s Hospital, Shenzhen 518035, China)

To investigate the effects of temperature on microencapsulated recombinant CHO (rCHO) cells proliferation, metabolism and recombinant protein expression, microencapsulated rCHO cells were cultured under different temperature. MTT method was used to measure the cell density, biosensor was used to measure the metabolism of glucose and lactate, and fibrin plate assay was used to measure the expression of DSPA protein. Lower temperature inhibited the cell growth rate and cell density, but improved the DSPA production capacity of microencapsulated rCHO. The DSPA production increased by 41% at 33℃ compared with 37℃.

microencapsulated; temperature; recombinant protein expression; cell culture

2016-11-30；

2016-12-13

国家自然科学基金(21602138)；深圳市三名工程；深圳市科创委学科布局项目(JCYJ20160229204849975)；高水平医学学科建设专项基金(2016031638)；深圳市科创委企业工程中心项目(GCZX2015043017281705)

王 雨，博士，助理研究员，研究方向为生物医学工程，E-mail:sszzxeno@126.com

牟丽莎，博士，副研究员，研究方向为生物医学工程， E-mail:molly__molly@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.013

Q813; Q819

A

2095-1736(2017)06-0013-06