·

慢性心力衰竭病人外周Th17细胞功能检测的临床意义

古丽仙·玉素甫

目的探讨慢性心力衰竭病人外周血中CD4+IL-17+ Th17细胞及白介素-6(IL-6)、白介素-22(IL-23)、白介素-17(IL-17)、RORγt的表达变化及其与慢性心力衰竭病程进展的关系。方法选取2013年1月—2014年6月在我院心血管内科确诊的慢性心力衰竭病人60例，同期无心脏疾病的健康人30名为对照。分别抽取不同心功能分级的慢性心力衰竭病人及对照者外周血，以流式细胞术检测外周血中CD4+IL-17+ Th17细胞表达水平，real-time PCR检测外周血单核细胞(PBMC)中IL-6、IL-23、IL-17、RORγt基因表达变化。结果慢性心力衰竭病人CD4+IL-17+辅助性T细胞17(Th17)百分率、Th17细胞特异性转录因子RORγt和IL-6、IL-23、IL-17基因表达水平均明显高于健康对照组(P<0.05)；与心功能分级为Ⅰ级～Ⅱ级慢性心力衰竭病人相比，心功能分级为Ⅲ级～Ⅳ级慢性心力衰竭病人Th17细胞百分率以及RORγt、IL-6、IL-23、IL-17基因表达水平均显著升高(P<0.01)。结论慢性心力衰竭病人中Th17细胞及其功能相关细胞因子表达情况与慢性心力衰竭病人病情的进展呈正相关，心力衰竭越严重，Th17表达率越高。因此，抑制Th17细胞及其功能相关细胞因子的表达是治疗慢性心力衰竭的重要措施。

慢性心力衰竭； 辅助性T细胞17；白介素-17；RORγt；白介素-6；白介素-23

慢性充血性心力衰竭(chronic congestive heart failure，CHF)是一种复杂的心室异构综合征[1]。众多学者从免疫学角度研究其发病机制发现，慢性心力衰竭病人处于免疫激活及炎症持续反应状态，炎症因子水平急剧上升[2]。传统的治疗慢性心力衰竭药物研究中发现具有抗炎症因子作用，例如卡托普利和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂洛沙坦可以抑制慢性心力衰竭病人肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的水平。辅助性T细胞17(Th17)是由TH0细胞在IL-6和白介素-23(IL-23)的刺激下分化而成的辅助性T细胞，主要分泌白介素-17(IL-17)、白介素-22(IL-22)等促炎症因子，RORγt是其重要的转录因子[3]。Th17 细胞的发现是近来免疫学研究的重大突破，对深入研究炎症、自身免疫病等免疫学机制具有重要意义[4]。本研究拟通过检测慢性心力衰竭病人外周血中CD4+IL-17+ Th17细胞及IL-6、IL-23、IL-17、RORγt的表达变化，进一步阐明Th17细胞及其作用因子在慢性心力衰竭中发挥的作用，探讨Th17细胞功能与慢性心力衰竭病程进展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年1月—2014年6月在我院心血管内科确诊的慢性心力衰竭病人60例，男42例，女28例；病程1年～8年；年龄48岁～76岁(62.82岁±8.60岁)；其中高血压性心脏病18例，冠心病20例，扩张型心肌病11例，瓣膜性心脏病11例。入选标准：参照中华医学会心血管病学分会2007年制定的《中国慢性心力衰竭诊断治疗指南》确诊为CHF至少3个月；纽约心脏病学会(NYHA)心功能Ⅰ级～Ⅳ级；左室射血分数(LVEF)<40%。排除标准：自身免疫性疾病病人，静息状态下心率<55次/min、血压≤90 /50 mmHg，肝肾功能不全病人。60例慢性心力衰竭病人按照心功能状况分为A、B两组：A组(心功能Ⅰ级～Ⅱ级)28例，B组(心功能Ⅲ～Ⅳ级)32例，两组病人的年龄、性别、基础疾病构成、心功能分级等比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究方案经过医院伦理学委员会审查批准，所有受试对象均知情同意。病人确诊后详细观察心衰的症状、心率、心律、血压、呼吸等变化，记录心电图及24 h动态心电图。另选择同期在本院体检的心功能正常人30名为健康对照组，其中男16名，女14名，年龄(56.24±12.13岁)。

1.2 主要试剂与仪器 RPMI 1640和胎牛血清(美国Thermo公司)；人淋巴细胞分离液 (天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；佛波醇乙酯(PMA)、离子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、破膜剂、CD4-FITC、IL-17A-APC流式抗体；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒以及Fast Start Universal SYBR Green Master荧光定量RT-PCR试剂盒，德国Roche公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；BD FACSVerseTMSystem流式细胞仪，美国BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 心功能的测定 于入院24 h 内测定心功能，采用GE公司的心脏彩超仪于左心长轴切面健索水平取M 型超声测得左室射血分数，在胸骨旁左心长轴切面腿索水平测得左室舒张末期内径(LVEDd)。

1.3.2 Th17细胞检测 采集慢性心力衰竭病人和健康对照者前臂外周抗凝血5 mL，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106/mL)200 μL，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，加入刺激剂PMA及离子霉素、莫能霉素等工作液并混匀，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养4 h～6 h。用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，离心收集细胞，加人5 μL异硫氰酸荧光素标记的CD4(CD4-FITC)、5 μL藻红蛋白标记的IL-17(IL-17A-APC)，操作按试剂盒说明书进行，采用流式细胞仪检测Th17细胞。

1.3.3 RORγt、IL-6、IL-23、IL-17 mRNA检测 采集各实验组人群外周抗凝血3 mL，用人淋巴细胞分离液提取外周血单核细胞(PBMC，1×106/mL)，以TRIzol一步法提取总RNA，逆转录反应参照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒说明书合成cDNA，采用Primer5程序设计5对引物，经BLAST数据库比对后，选择最佳候选引物，由上海Invitrogen公司合成。引物序列如下： RORγt，F-5’-TCAAGT TTGGCCGAATGTC-3’，R-5’-CATCTGAGAGCCCTAAAGTGTATG-3’，368bp；IL-6，F-5’-GGTACATCCTCGACGGCATCTC-3’，R-5’-GTTGGGTCAGGGGTGGTTATTG-3’，334bp；IL-17A，F-5’AATCTCCACCGCAATGAGGA3’，R-5’ACGTTCCCATCAGCGTTGA3’；IL-23，F- 5’AATCTCCACCGCAATGAGGA3’，R-5’ACGTTCCCATCAGCGTTGA3’，311bp，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)：5’-CTCTC TGCTCCTCCTGTTCGAC- 3’和5’-TGAGCGATGTGGCTCGG CT-3’，256bp；扩增反应条件：95 ℃ 5 min，40个循环的95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min。PCR实验结束后进行产物的熔解曲线分析，系统软件自动分析在每个周期中产生的荧光信号，阈循环值用于确定与甘油醛-3 - 磷酸脱氢酶作为参考基因的基因表达的相对定量。

2 结 果

2.1 慢性心力衰竭病人与对照者心功能指标变化 两组治疗后心功能指标与正健康对照组相比，LVEF显著增加(P<0.05)，LVEDd显著缩小(P<0.05)；同时，A组病人LVEF明显低于B组(P<0.05)，LVEDd较B组明显增大(P<0.05)。详见表1。

组别nLVEF(%)LVEDd(mm)A组 2851．6±4．21)56．5±4．11)B组 32 31．0±5．21)2) 65．1±5．21)2)健康对照组3064．2±5．546．1±5．7 与健康对照组相比，1)P<0．05；与A组相比，2)P<0．05。

2.2 慢性心力衰竭病人与对照者外周血中Th17细胞的表达比较 健康对照组CD4+IL-17+T细胞百分率为显著低于A组[(0.495±0.309)% vs(1.556±0.491)%，t=-21.07，P<0.001]及B组[(0.495±0.309)% vs(2.862±0.247)%，t=-13.676，P<0.01]，与A组相比，B组Th17细胞百分率显著升高[(0.895±0.309)%vs (0.557±0.163)%，t=2.396，P<0.05]。详见图1。

图1 慢性心力衰竭病人与对照者外周血中Th17细胞的表达比较

2.3 各组外周血单核细胞中RORt、IL-6、IL-17、IL-23基因表达(见表2)

组别nRORγtIL⁃6IL⁃17IL⁃23健康对照组300．774±0．1081．021±0．3040．285±0．0680．385±0．068A组 280．974±0．2121)1．706±0．5071)0．728±0．1141)0．563±0．0591)B组 32 1．190±0．2031)2)2．937±0．6041)2)1．390±0．2031)2)0．801±0．0141)2) 与健康对照组比较，1)P<0．05；与A组比较，2)P<0．05。

3 讨 论

慢性充血性心力衰竭是由于钠、水潴留和血容量增加引起的充血性心力衰竭过程，CHF同时也是一个免疫激活的过程，与机体的炎症反应过程密切相关[5]。机体免疫病理损伤在慢性心力衰竭发病过程中发挥重要作用[6]，新近的流行病学研究显示，CHF病人体内的炎症水平升高，免疫系统紊乱及细胞因子紊乱失衡是慢性心力衰竭重要的致命因素之一。近来研究表明Th17细胞是Th细胞中作用最强的促炎细胞。因此，Th17细胞在CHF的发生和发展中所扮演的角色是值得研究者关注的[7]。

Th17细胞是近年发现的一种新的不同于Th1、Th2的CD4+T细胞亚群，研究发现[8]，Th17可能是重要的自身免疫性和炎性疾病发病过程的主要调节者，绝大多数病人发生慢性心力衰竭时表现为免疫抑制及炎症反应。IL-6和转化生长因子-β(TGF-β)的存在下，幼稚的CD4+T细胞分化为Th17细胞，并产生其主要效应因子IL-17(主要是指IL-17A)[9]。IL-17是1995年发现的一类来源于T细胞的促炎细胞因子。IL-17与受体结合后，可以作用于多种细胞类型来诱导产生细胞因子[包括TNF-α、IL-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-23]，发挥着促进炎症发展、免疫应答等多种功能[10]。TNF-α、IL-6与CHF有着密切的关系。心衰病人血液循环中TNF-α、IL-6浓度显著高于正常人，且与CHF严重程度呈正相关。TNF-α不仅可以通过阻止细胞内钙浓度的增高诱导心肌收缩功能异常，而且可以诱导心肌细胞和内皮细胞的凋亡[11]；而正常的心脏中无IL-6表达，当CHF发生时，心肌细胞可以产生IL-6，直接损伤心肌细胞并通过IL-6-GP130-STAT3信号转导途径诱导心肌细胞肥大，同时慢性心力衰竭病人体内IL-6的升高刺激机体中性粒细胞表面黏附分子的表达，中性粒细胞的黏附及内皮迁移造成对心肌的浸润及损伤[12]。因此，Th17细胞分化和免疫功能的调控研究具有重要的基础和临床应用价值。

本研究观察不同心功能分级的慢性心力衰竭病人及对照者外周血CD4+IL-17+ Th17细胞的表达频率及表达水平，real-time PCR检测外周血单核细胞中IL-6、IL-23、IL-17、RORγt基因表达变化，推断出Th17、IL-17等在慢性心力衰竭中可能起到的作用。慢性心力衰竭病人CD4+IL-17+ Th17细胞百分率、Th17细胞特异性转录因子RORγt和IL-6、IL-23、IL-17基因表达水平均明显高于健康对照组(P<0.05)；慢性心力衰竭心功能Ⅲ级～Ⅳ级病人Th17细胞百分率以及RORγt、IL-6、IL-23、IL-17基因表达水平均较心功能分级为Ⅰ级～Ⅱ级病人显著升高(P<0.01)。提示，慢性心力衰竭病人大量Th17细胞被活化，通过分泌IL-6、IL-17、IL-23来招募中性粒细胞等参与心脏炎症过程，进一步加重心力衰竭，提示Th17可能是导致慢性心力衰竭的一个因素。Lichtman[10]在慢性心力衰竭病人外周血中的Treg/Th17表达不平衡研究中发现，病人外周血的Th17细胞明显增加，与本研究结果一致，CHF的疾病进程与机体的炎症过程密切相关，这提示纠正Th17细胞的功能失调可能会对CHF的防治起到积极作用。

慢性心力衰竭的发病机制与Th17细胞功能失调密切相关。尽管对CHF的Th17细胞研究已经引起了广泛的关注，并取得了一定进展，但Th17细胞与CHF之间的相互关系及其具体机制，将有待于增加样本量，进一步扩大研究，为指导临床治疗提供参考。

[1] Pereira IR，Vilar-Pereira G，Silva AA，et al.Tumor necrosis factor is a therapeutic target for immunological unbalance and cardiac abnormalities in chronic experimental chagas’heart disease[J].Mediators Inflamm，2014，2014：798078.

[2] Bouras G，Giannopoulos G，Hatzis G，et al.Inflammation and chronic heart failure：from biomarkers to novel anti-inflammatory therapeutic strategies[J].Med Chem，2014，33(3)：343-348.

[3] Moro-García MA，Echeverría A，Galán-Artímez MC，et al.Immunosenescence and inflammation characterize chronic heart failure patients with more advanced disease[J].Int J Cardiol，2014，174(3)：590-599.

[4] Huang M，Yang D，Xiang M，et al.Role of interleukin-6 in regulation of immune responses to remodeling after myocardial infarction[J].Heart Fail Rev，2014，23(5)：341-346.

[5] Lin H，Li HF，Chen HH，et al.Activating transcription factor 3 protects against pressure-overload heart failure via the autophagy molecule Beclin-1 pathway[J].Mol Pharmacol，2014，85(5)：682-691.

[6] Longenecker CT，Triant VA.Initiation of antiretroviral therapy at high CD4cell counts：does it reduce the risk of cardiovascular disease? [J].Curr Opin HIV AIDS，2014，9(1)：54-62.

[7] Koller L，Richter B，Goliasch G，et al.CD4+CD28(null) cells are an independent predictor of mortality in patients with heart failure[J].Atherosclerosis，2013，230(2)：414-416.

[8] Vasconcelos JF，Souza BS，Lins TF，et al.Administration of granulocyte colony-stimulating factor induces immunomodulation，recruitment of T regulatory cells，reduction of myocarditis and decrease of parasite load in a mouse model of chronic Chagas disease cardiomyopathy[J].FASEB J，2013，27(12)：4691-4702.

[9] Fantuzzi G.Adiponectin in inflammatory and immune-mediated diseases[J].Cytokine，2013，64(1)：1-10.

[10] Lichtman AH.The heart of the matter：protection of the myocardium from T cells[J].J Autoimmun，2013，45：90-96.

[11] Fujiu K，Nagai R.Contributions of cardiomyocyte-cardiac fibroblast-immune cell interactions in heart failure development[J].Basic Res Cardiol，2013，108(4)：357.

[12] Nikolic VN，Jevtovic-Stoimenov T，Stokanovic D，et al.An inverse correlation between TNF alpha serum levels and heart rate variability in patients with heart failure[J].J Cardiol，2013，62(1)：37-43.

Significance of Peripheral Th17 Cells Function in Patients with Chronic Heart Failure

Gulixian·Yusufu

Hospital of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 811601，Xinjiang，China

Objective To investigate the expression of the peripheral blood CD4+interleukin (IL)-17+ T helper cell 17 (Th17) cells and IL-6，IL-23，IL-17，ROR gamma t (RORγt)，and its relationship with the progression of chronic heart failure (CHF).Methods Sixty patients with CHF were selected in our hospital from January 2013 to June 2013.Thirty healthy individuals were as controls in the same period.The levels of CD4+IL-17+Th17 cells in peripheral blood were detected by flow cytometry. The levels of IL-6，IL-23，IL-17，RORγt gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were detected by real-time PCR. Results The percentage of CD4+IL-17 +Th17 cells，Th17 cell-specific transcription factors RORγt and IL-6，IL-23 and IL-17 in patients with CHF were significantly higher than those in healthy controls.The percentage of CD4+IL-17 +Th17 cells，Th17 cell-specific transcription factors RORγt and IL-6，IL-23 and IL-17 in CHF patients with New York Heart Association (NYHA) functional classification Ⅲ-Ⅳ were significantly higher than those in CHF patients with NYHA Ⅰ-Ⅱ(all P<0.01). Conclusion The expression of Th17 cells and their function-related cytokines in patients with CHF is positively correlated with the progression of the disease in elderly patients with CHF.The expression of Th17 was the higher in patients with severe heart failure.Therefore，the inhibition of the expression of Th17 cells and their function-related cytokines is an important treatment for patients with CHF.

chronic heart failure；T helper cell 17；interleukin-17；ROR gamma t；interleukin-6；interleukin-23

R541.6 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.023

1672-1349(2017)22-2877-04

新疆维吾尔自治区维吾尔医医院(乌鲁木齐 811601)，E-mail：gtuirebhdsfgb@163.com

信息：古丽仙·玉素甫.慢性心力衰竭病人外周Th17细胞功能检测的临床意义[J].中西医结合心脑血管病杂志，2017，15(22)：2877-2880.

2017-05-16)

(本文编辑 郭怀印)