路如心 刘 洋 魏 敏 李祎楠 连丹婕 张 媛 周洪霞

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

重组人粒细胞集落刺激因子对脑出血大鼠继发性炎症损伤的影响

路如心 刘 洋 魏 敏 李祎楠 连丹婕 张 媛 周洪霞

华北理工大学基础医学院 河北唐山 063000

①目的 探讨重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)对脑出血大鼠炎症损伤的影响及其机制。②方法 选择健康雄性大鼠60只，随机分为对照组、模型组和观察组。模型组和观察组采用右侧脑组织基底节内注入新鲜自体不凝血复制脑出血模型，对照组仅经注射点注入生理盐水。脑出血建模成功后观察组在术后6小时开始每天腹部皮下注射rhG-CSF。另两组腹部皮下注射等量生理盐水。采用干湿重法测定各组大鼠病灶周围脑组织含水量(BWC)，用免疫组织化学法及免疫蛋白印记法观察大鼠病灶周围脑组织Toll 样受体-4(TLR-4)、核因子-κB 受体(NF-κB)的免疫阳性细胞数及蛋白表达水平。③结果 观察组术后各时间点BWC值均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后病灶周围脑组织TLR-4、NF-κB阳性细胞计数均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；TLR-4、NF-κB蛋白表达量均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。④结论 rhG-CSF可能通过降低TLR-4、NF-κB的表达，减轻继发性脑水肿及神经细胞损伤，对脑出血大鼠脑组织起保护作用。

脑出血 重组人粒细胞集落刺激因子 Toll 样受体-4 炎症反应

脑出血是临床常见病、多发病，其致残率、致死率都比较高。迄今越来越多的研究发现，炎症反应在继发性脑出血损伤中起重要作用，主要表现为中性粒细胞浸润以及小胶质细胞过度活化等，进而这些炎性细胞又释放出多种细胞因子，如肿瘤坏死因子、白细胞介素和氧自由基等，使神经损伤更加严重[1]。近年来有实验证实，重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)具有抗炎症、抗凋亡、减轻脑出血水肿等作用，但其机制需进一步证实。本实验拟用rhG-CSF治疗脑出血后炎症损伤，探讨其可能的治疗机制，为临床rhG-CSF的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择健康雄性大鼠60只，体质量250～300g，鼠龄3～4个月，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。动物证号：SCXK(京)2016-0011。

1.2药物与试剂 rhG-CSF注射液购于浙江南洋药业有限公司，TLR-4兔抗鼠多克隆抗体、核因子-κB受体(NF-κB)多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。其他试剂为国产分析纯。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及处理 实验动物随机分为对照组、模型组、观察组，每组20只；每组按照时间分为12、24、48、72小时亚组。模型组、观察组采用右侧脑组织基底节内注入新鲜自体不凝血复制脑出血模型，对照组仅经注射点注入生理盐水。脑出血后观察组在术后4小时开始每天腹部皮下注射rhG-CSF。另两组腹部皮下注射等量生理盐水。

1.3.2取材固定切片 将各组大鼠于术后相应观察时间点麻醉开颅，4%多聚甲醛灌注固定，取脑，样本置于4%多聚甲醛固定14～24小时，然后将其置于30%的蔗糖溶液过夜，直至脑组织沉淀。次日取脑组织进行冠状切片，片厚10μm，放置在载玻片上。进行免疫组织化学染色。取各组相应观察时间点进行麻醉，断头取脑，-80℃冰箱保存，待进行免疫蛋白印记检测。

1.3.3脑含水量测定 脑组织含水量(water content of brain ，BWC)的测定：各组实验完成处死动物，取出脑组织，用分析天平秤质量，在恒温箱中烘干，后秤干质量，应用公式BWC=(湿质量-干质量)/湿质量×100% 。

1.3.4免疫组织化学染色 取脑组织切片室温放置30分钟后，用TBST洗涤，同一组织相邻切片分别加入TLR-4兔抗鼠多克隆抗体、NF-κB多克隆抗体，4℃过夜，然后用TBST洗涤3次，每次洗3分钟，DAB显色，进行封片，显微镜图像采集。

1.3.5免疫蛋白印记检测 将大鼠麻醉后取脑，并用PBS冲洗表面血液清洗脑组织，然后将干净脑组织置于盛有低温裂解液的离心管中，震荡约30分钟，12000r/min，离心15分钟，取上清液，-80℃保存备用。取上清液加入4倍体积样本缓冲液，95℃下处理5分钟,取20μg样本SDS-PAGE上电泳，将PVDF膜取出后放在封闭的培养皿中，分别加入TLR-4兔抗鼠多克隆抗体(1:500稀释)、NF-κB多克隆抗体(1:500稀释)，4℃过夜，再次用TBST冲洗5次，再将膜转移入孵育盒中，室温震荡孵育2小时，用TBST漂洗5次，DAB显色。选用CMIAS真彩色医学图像免疫组化自动分析仪进行阳性细胞计数，切片在400倍光镜下观察。

2 结果

2.1脑组织含水量分析 大鼠脑出血模型术后各组BWC 明显升高，说明有脑水肿形成，各时间点相比较72 小时最为严重。模型组不同时间BWC均为高于观察组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 建模后各组小鼠不同时间点病变周围脑组织含水量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

2.2免疫组织化学检测结果 观察脑出血建模72 小时各组TLR-4和 NF-κB阳性细胞数量的变化。结果显示，与对照组比较，观察组和模型组TLR-4和 NF-κB阳性细胞数显著增高；与模型组比较，观察组TLR-4和 NF-κB阳性细胞数均降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 脑出血建模72h各组大鼠脑组织 TLR-4、NF-κB阳性细胞数量比较个/HP)

注：与对照组比较，*P<0.05vs；与模型组比较，#P<0.05

2.3免疫蛋白印记法检测TLR-4和 NF-κB的蛋白表达量 通过电泳条带灵敏度分析，观察脑出血建模72小时各组TLR-4和NF-κB蛋白表达量。结果显示，与对照组比较，观察组和模型组TLR-4、NF-κB蛋白表达量均显著增高；与模型组比较，观察组TLR-4、NF-κB蛋白表达量均降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 脑出血建模72h各组大鼠脑组织TLR-4和NF-κB蛋白表达量单位)

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

3 讨论

脑出血已成为威胁人类生命健康的公共卫生问题。其发病的病理变化是多因素参与的复杂过程。在脑出血后，出现包括脑水肿、血肿周围缺氧、炎症反应和细胞凋亡等一系列继发病理生理过程造成进一步神经损伤[2]。其中脑水肿及炎症反应在临床研究中也越来越受到人们的重视。

rhG-CSF是骨髓间充质干细胞强有力的动员剂，具有抗炎的作用[3]。实验发现rhG-CSF 基因敲除后的大鼠行脑缺血再灌注后，神经功能缺损及脑梗死体积较未敲除组严重，给予rhG-CSF 后这一效应可改善。脑水肿使血脑屏障受到破坏，进而蛋白释放到间隙，又释放了生物活性物质、炎性递质等，继而发生了相关性水肿[4]。目前发现rhG-CSF 可能通过下调IL-1β、iNOS 等炎症因子从而发挥抗炎症作用，减轻血脑屏障渗透性[5]。本实验的研究结果也显示，在建模后不同的时间点观察组BWC值均低于模型组，72小时达到高峰。使用rhG-CSF可以降低脑水肿程度，使含水量降低。可能是通过降低炎症因子水平发挥抗炎作用，进而减轻了脑水肿程度。

Toll样受体是TLRs家族重要的成员，为跨膜受体，能激活NF-κB启动并放大炎症反应。中枢系统中NF-κB在星形胶质细胞、小胶质细胞、神经元中都有表达，研究显示[6]，脑出血发病过程中，脑组织缺血、缺氧可刺激炎性细胞、神经元及胶质细胞，使NF-κB活化，进而激活机体应激性炎性反应[7]。目前发现rhG-CSF可有效降低 NF-κB信号通路介导的的炎症反应，从而发挥抗炎症作用。本研究中，观察组建模后72小时病灶周围脑组织NF-κB和TLR-4阳性细胞计数、NF-κB和TLR-4蛋白表达量明显低于模型组(P<0.05)，使其下游的炎症因子的表达也减少，进而减轻了脑组织损伤。免疫组织化学染色显示rhG-CSF治疗后，血肿周围TLR-4和NF-κB阳性细胞数量明显减少，表明rhG-CSF可能通过下调TLR-4诱导的NF-κB信号通路表达，进而减轻脑出血大鼠脑组织继发性炎症损伤，对脑组织起保护作用。rhG-CSF发挥抗炎作用的确切机制有待进一步探讨。

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(2017-03-14收稿)(张爱国 编辑)

Effectofrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactoronsecondaryinflammatorydamageinratsafterintracerebralhemorrhage

LURuxin,LIUYang,WEIMin,etal

(CollegeofElementaryMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo explore the effect and mechanism of recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) on inflammatory injury in rats with intracerebral hemorrhage (ICH).MethodsSixty healthy male rats were randomly divided into control group, model groupand observation group, the model group and observation group were adopted the right brain tissue in the basal ganglia to injected fresh autologous blood to copy the model of intracerebral hemorrhage. The control group were injected with saline.After treatment,the patients in the observation group

abdominal subcutaneous injection of rhG-CSF every day after 6h.The other two groups were injected with normal saline. Determination of brain tissue around the lesion rats water content by dry wet weight method (BWC),by immune histochemistry and western blot technique, observed the Toll like receptor in rat brain tissue around the lesion in 4 (TLR4),the expression level of the positive cell number and protein NF-kappa B.ResultsRecombinant human granulocyte colony-stimulating factor observation group at each time point after operation BWC values were lower than the model group(P<0.05);the observation group after brain lesions around TLR4, NF-kappa B positive cell counts were lower than the model group(P<0.05),and around the lesion of brain tissue TLR4 and NF-kappa B protein expression was significantly lower than the model group(P<0.05).ConclusionHecombinant human granulocyte colony-stimulating factor may be through reducing the expression TLR4, NF-kappa B,alleviate cerebral edema and nerve cell injury, protective effect on brain tissue of rats with brain hemorrhage.

Cerebral hemorrhage.Recombinant human granulocyte colony-stimulating factor.Toll like receptor4.Inflammatory reaction

R 743.33

A

2095-2694(2017)06-430-04

2016年河北省社会科学基金项目(编号：HB16LJ006)；华北理工大学创新创业训练计划项目(编号:X2016150)。

路如心(1996-)，女，本科生。研究方向：脑出血。

周洪霞。