杨振丽 卞晓翠 冯海凉 刘玉琴

100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 细胞资源中心

人源细胞系中6种主要病毒的检测

杨振丽 卞晓翠 冯海凉 刘玉琴

100005 北京，中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 细胞资源中心

目的检测人源细胞系中EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、人乳头瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)、人T淋巴细胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)的感染情况。方法对中心库藏常用的135株人源细胞系分别提取细胞DNA及RNA，采用PCR方法对细胞中的EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV进行检测；采用RT-PCR方法对细胞中的HCV进行检测；利用透射电镜观察细胞中是否有病毒颗粒；对经PCR检测HPV核酸片段阳性的细胞系，再利用特异性引物采用PCR方法检测5种高危型HPV(HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45)。结果经PCR检测，135株细胞系中，有4株细胞系(Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009)中检测到EBV 核酸片段；2株细胞系(Hep3B、PLC/PRF/5)中检测到HBV核酸片段；7株细胞系(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、SiHa、Ca Ski、CNE-2Z)中检测到HPV核酸片段，其中2株(SiHa、Ca Ski)基因型为HPV16，5株(HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3、CNE-2Z)基因型为HPV18；1株细胞系(HUT 102)中检测到HTLV核酸片段；没有细胞系中检测到HIV核酸片段；经RT-PCR检测，没有细胞系携带HCV核酸片段。透射电镜下，病毒核酸阳性的细胞系中未观察到病毒颗粒，部分细胞系内可见病毒包涵体类似物。结论PCR或RT-PCR可以用于检测细胞系中病毒核酸的携带情况；细胞系中病毒核酸以基因组整合的形式存在。

细胞系在生命科学研究中是不可或缺的，其中大部分人源细胞系来源于患者组织，特别是肿瘤细胞系。病毒与某些疾病的发生发展密切相关[1-4]，如乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)与肝癌、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)与丙型肝炎、EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)与淋巴瘤及鼻咽癌、人乳头瘤病毒(Human pappilomavirus, HPV)与宫颈癌、人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)与艾滋病、人T淋巴细胞白血病病毒(Human T-cell leukemia virus, HTLV)与T淋巴细胞白血病等。细胞中所携带的病毒或因细胞来源的患者本身感染了某种病毒，也或是由于某些原因而人为引入的外源病毒，如应用EBV感染B淋巴细胞从而建立B淋巴细胞系作为细胞模型用于实验研究。本文通过PCR或RT-PCR及透射电镜等方法对本中心库藏的135株人源细胞系进行了检测，并应用PCR的方法检测了携带HPV核酸片段的细胞系中HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45等5种高危型的感染情况。

1 材料与方法

1.1材料所用细胞系及其培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等均由国家实验细胞资源共享服务平台中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供。DNA提取试剂盒Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒RNeasy® Mini kit及逆转录试剂盒QuantiTect® Reverse Transcription Kit购自Qiangen公司；所用引物由Invitrogen公司合成；2×EasyTaq PCR SuperMix for PAGE及100 bp DNA Ladder购自北京全式金生物技术有限公司；HCV RNA由北京大学肝病研究所提供。

1.2方法

1.2.1 细胞DNA及RNA提取:取对数生长期的细胞，按DNA提取试剂盒(Pure linkTMGenomic DNA Mini Kit)说明书提取细胞DNA，用于检测EBV、HBV、HPV、HIV、HTLV核酸片段； 按RNA提取试剂盒(RNeasy® Mini kit)说明书提取细胞RNA，用于检测HCV核酸片段。DNA及RNA分装后-80 ℃保存。

1.2.2 cDNA合成:按逆转录试剂盒(QuantiTect® Reverse Transcription Kit)说明书将细胞RNA逆转录为cDNA，用于RT-PCR检测HCV核酸片段，分装后-80 ℃保存。

表1 PCR或RT-PCR检测病毒核酸携带情况所用引物

1.2.3 引物设计:根据文献报道及NCBI数据库信息选取，并利用primer5.0软件设计相应引物。所用引物经Blast比对验证(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。

1.2.4 PCR反应:HBV阳性对照为Hep3B细胞的DNA；HCV阳性对照为HCV RNA经逆转录而获得的cDNA；EBV阳性对照为B95-8细胞的DNA；HPV阳性对照为HeLa细胞的DNA; HIV 阳性对照为含HIV gag片段的质粒；HTLV 阳性对照为HUT 102细胞的DNA；以ddH2O为模板作为阴性对照。PCR体系为20 μl，其组份为：PCR super mix 10 μl，上下游引物各1 μl，模板DNA或cDNA 1 μl (100 ng)，ddH2O补足至20 μl。PCR反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃最终延伸10 min。

1.2.5 透射电镜观察:每种细胞约1×107个细胞，移入1.5 ml EP管中，离心，弃上清，加入1.5 ml新鲜配制的2.5%戊二醛固定液，4 ℃固定。由中国医学科学院基础医学研究所仪器中心电镜室进行样品制备，经透射电子显微镜TEM-1010进行观察。

2 结果

2.1携带EBV核酸片段的细胞系对135株人源细胞系的DNA分别进行PCR扩增，以EBV引物扩增得到阳性产物的只有Daudi、Raji、EB-3、NCI-BL2009 细胞。而这4种细胞DNA，以其他引物进行扩增，没有扩增出相应大小的阳性条带。结果见图1。

2.2携带HBV核酸片段的细胞系细胞DNA分别以HBV引物进行PCR扩增，只有Hep3B和PLC/PRF/5细胞可扩增出与阳性对照相应大小的条带，而这2种细胞系以其他引物没有扩增出阳性条带。结果如图2所示。

图1 经PCR检测携带EB病毒核酸片段的细胞系Fig.1 Detection of cell lines harbored EBV DNA sequences by PCR

图2 经PCR检测携带乙型肝炎病毒核酸片段的细胞系Fig.2 Detection of cell lines harbored HBV DNA sequences by PCR

图3 经PCR检测携带人乳头瘤病毒核酸片段的细胞系Fig.3 Detection of cell lines harbored HPV DNA sequences by PCR

2.3携带HPV核酸片段的细胞系及高危型HPV检测细胞DNA分别以HPV引物(MY09和MY11)进行PCR扩增，宫颈癌细胞HeLa、SiHa、Ca Ski的细胞DNA经HPV引物扩增后，可出现与阳性对照相一致的条带，而其他引物没有扩增出阳性条带；HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3细胞与HeLa细胞结果一致；其中HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3细胞在基因型HPV18引物扩增下，可出现相应大小的阳性条带，其他基因型引物无阳性扩增产物；SiHa、Ca Ski细胞经基因型HPV16引物扩增后，出现相应大小的阳性条带，而其他基因型无阳性条带。鼻咽癌细胞CNE-2Z细胞在HPV引物扩增下，可产生与阳性对照大小一致的条带，而在其他引物扩增下没有相应大小的阳性条带；经基因型HPV18引物扩增后，可产生相应大小的阳性条带。HPV检测结果见图3，高危型HPV检测结果如表2所述。

表2 高危型人乳头瘤病毒PCR检测结果

2.4透射电镜观察细胞内病毒颗粒经透射电镜观察，未发现病毒核酸阳性的细胞中有病毒颗粒存在。但在细胞核和/或细胞质中发现了大小不均、个数不等的类似病毒包涵体的结构。高倍放大后观察，可见该结构为大小均一的颗粒样物质聚集而成，周围无膜类物质包裹，但与周围成份分界明显。其中，该结构在Ca Ski、HeLa、HUT 102等细胞中较多(如图4，黑色箭头所示)；Daudi细胞中也有少量该结构；NCI-BL2009、PLC/PRF/5中没有发现明显的以上结构。同时，在Raji细胞中发现含有类似管状膜样结构的包涵体样结构(如图4，白色箭头所示)。

3 讨论

细胞系多取材于患者的病灶组织，这些组织可能携带有病人自身感染的某些与疾病相关的病毒，导致细胞系中也会携带该病毒。因此，本研究选取部分人类易感染的致病病毒，如EBV、HBV、HCV、HPV、HIV、HTLV等作为检测目标，应用PCR或RT-PCR及透射电镜等方法对库藏人源细胞系的病毒感染情况进行了检测。

图4 经透射电镜观察细胞内有病毒包涵体类似物Fig.4 Detection of viral inclusion bodies in cell lines by TEM

PCR或RT-PCR可用于检测细胞系的病毒核酸携带情况。EBV、HBV、HPV为DNA病毒，HIV、HTLV为逆转录病毒，因此本研究采用PCR的方法检测了细胞DNA；HCV为RNA病毒，因此本研究提取了细胞RNA采用RT-PCR的方法进行检测。经检测，本中心库藏的135株人源细胞系中，共发现14株细胞系中存在相应病毒核酸片段。其中，携带EBV核酸片段的细胞系中，除NCI-BL2009细胞为EBV转化的外周血B淋巴细胞外，其余3株均来自Burkitt淋巴瘤患者；携带HBV核酸片段的Hep3B和PLC/PRF/5细胞均来自肝癌患者；携带HPV18核酸片段的HeLa、HeLa 229、H1HeLa、HeLaS3细胞及携带HPV16核酸片段的SiHa、Ca Ski细胞均来自宫颈癌患者；鼻咽癌细胞CNE-2Z中未检测到EBV核酸片段，但HPV扩增阳性，基因型为HPV18。由此可见，病毒在某些疾病的发生发展中起着至关重要的作用[1-4，8]。

携带病毒核酸片段的细胞系中没有完整的病毒颗粒。Uphoff等[6]通过检测ZEBRA蛋白的表达，发现只有个别细胞系经丁酸钠及TAP诱导后才会产生病毒颗粒，病毒在细胞中主要以基因组整合及游离形式存在。本研究经透射电镜进一步观察，携带病毒核酸片段的细胞内未发现病毒颗粒，仅部分细胞系(Ca Ski、HeLa、HUT 102、Raji等)的细胞质和/或核内可见大小不等的包涵体类似物。说明在常规培养过程中，这些细胞系不会产生完整的病毒颗粒。这些包涵体类似物与细胞的培养时间等是否有关，其构成、功能及发生发展都鲜有报道，李慧弘等[9]在HeLa细胞中也发现了这种结构，认为由HPV L1构成。本实验室也将继续研究该结构在细胞系中的组成及作用。

综上可见，应用针对不同病毒的特异性引物，经PCR或RT-PCR的方法检测细胞系是否携带病毒核酸是可行的；以上检测结果与文献报道一致[6]，也进一步验证了细胞系的正确性。所检测到的携带病毒核酸片段的细胞系可作为研究病毒与疾病关系的细胞模型。某些细胞系中含有的病毒包涵体类似物仍需进一步研究。

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2017-05-03)

(本文编辑：吕新军)

Detectionofsixmainspeciesofvirusesinhumancelllines

YangZhenli,BianXiaocui,FengHailiang,LiuYuqin

CellResourceCenter,InstituteofBasicMedicalSciencesChineseAcademyofMedicalSciences,SchoolofBasicMedicinePekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

LiuYuqin,Email:liuyuqin@pumc.edu.cn

ObjectiveTo clarify the virus hosting status of human cell lines.MethodsThe DNA of Epstein-Barr virus (EBV), Hepatitis B virus (HBV), Human pappilomavirus (HPV), Human immunodeficiency virus (HIV), Human T-cell leukemia virus (HTLV) in 135 human cell lines were checked using PCR, and HCV RNA sequences were checked by RT-PCR. The transmission electron microscopy (TEM) was used to examine the virus particles in cells. The high-risk genotypes of HPV were tested by PCR.ResultsBy PCR assaying, among the 135 human cell lines, four cell lines(Daudi, Raji, EB-3, NCI-BL2009) harbored EBV DNA sequences; two(Hep3B, PLC/PRF/5) harbored HBV DNA sequences; seven (HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, SiHa, Caski, CNE-2Z) harbored HPV DNA sequences, including two cell lines (SiHa, Caski) with HPV16, five cell lines(HeLa, HeLa 229, H1HeLa, HeLaS3, CNE-2Z) with HPV18; one cell line(HUT 102) harbored HTLV DNA sequences. No cell line harbored HCV RNA sequences and HIV DNA sequences. No viral particles were observed in the positive cell lines by TEM，but some viral inclusion bodies in certain cell lines.ConclusionsThe virus hosting status of human cell lines can be checked by PCR or RT-PCR. The viral DNA sequences were integrated in the cellular genome.

Cell lines; Virus; Polymerase chain reaction; Electron microscopy

刘玉琴，Email: liuyuqin@pumc.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.018

细胞系；病毒；聚合酶链式反应；电子显微镜