曾汉日 郑焕英 刘冷 陆靖 谭小华 孙立梅 方苓 李晖 柯昌文

511430 广州，广东省疾病预防控制中心(曾汉日、郑焕英、刘冷、谭小华、孙立梅、方苓、李晖、柯昌文)；511430 广州，广东省公共卫生研究院(陆靖)

2015年广东省广州地区疱疹性咽峡炎病原学特征分析

曾汉日 郑焕英 刘冷 陆靖 谭小华 孙立梅 方苓 李晖 柯昌文

511430 广州，广东省疾病预防控制中心(曾汉日、郑焕英、刘冷、谭小华、孙立梅、方苓、李晖、柯昌文)；511430 广州，广东省公共卫生研究院(陆靖)

目的了解2015年广东省广州地区疱疹性咽峡炎病原学特征，为疱疹性咽峡炎的防控提供数据基础。方法收集123例疱疹性咽峡炎病例的粪便标本和咽拭子标本共211份，采用荧光定量PCR和巢式PCR进行肠道病毒检测，肠道病毒阳性标本接种RDa细胞进行病毒分离，选取CVA6阳性标本或毒株进行VP1全长序列扩增与测序，运用DNAStar6.0和MEGA5.2软件对获取序列进行系统进化分析。结果123例疱疹性咽峡炎病例中，肠道病毒阳性率为93.50%，共检出CVA6、CVA10、CVA2、EV71、CVA16、CVB2、Echo14和Echo30等8种肠道病毒，其中CVA6阳性率最高(60.98%)，其次为CVA10(13.01%)；粪便标本肠道病毒阳性率(χ2=29.88,P<0.01)和病毒分离阳性率(χ2=8.67,P<0.01)均高于咽拭子标本；基于VP1全长序列遗传进化分析发现，疱疹性咽峡炎CVA6核苷酸同源性96.9%～99.9%，氨基酸同源性99.0%～100.0%，均属于D3基因亚型。结论2015年广东省广州地区疱疹性咽峡炎的病原体以A组肠道病毒为主，其中D3基因亚型的CVA6是优势流行株。

疱疹性咽峡炎(Herpangina, HA)是由人肠道病毒(Human enterovirus, HEV)引起的以发热、咽痛、咽峡部充血并出现散在灰白色疱疹和溃疡为主要临床特征的一种自限性疾病。常见于婴幼儿，传染性强，全年均可发生[1,2]。大多数病例症状较轻，可自愈，但少数病例可发展为重症病例，甚至引起死亡。疱疹性咽峡炎的病原体以肠道病毒柯萨奇病毒A群(Coxsackievirus group A)或EV71为主[3-4]，其中CVA1～CVA6、CVA8、CVA10和CVA22较为常见[5]。

近年来，疱疹性咽峡炎在世界上多个国家或地区广泛流行[6-7]，在国内部分城市也出现了暴发疫情[5,8-12]。然而，由于疱疹性咽峡炎在国内不属于法定传染病，目前报道较少，对于其病原研究更是缺乏。因此，为了解广东省广州地区疱疹性咽峡炎的病原学特征，本研究于2015年5月—8月期间收集了广州市儿童医院疱疹性咽峡炎病例的病原学标本进行病原检测并对其优势病原体进行基因分析，以期为疱疹性咽峡炎的防治提供病原学依据。

1 材料与方法

1.1材料来源2015年5月—8月期间，收集了由广州市儿童医院送检的123例疱疹性咽峡炎病例标本211份及病例基本信息，其中粪便标本101份，咽拭子标本110份。所有标本均在冷藏条件下送检并及时置于-70 ℃冰箱保存。

1.2核酸检测与病毒分型标本经前处理后，采用德国Qiagen公司Viral RNA Mini Kit试剂盒进行病毒核酸提取，运用江苏硕世公司的荧光定量PCR试剂进行总肠道病毒检测，对于阳性标本进行EV71、CVA16、CVA6和CVA10荧光定量PCR分型鉴定检测，如果这4种病毒均为阴性，则运用半巢式PCR(Semi-nested PCR, Sn-PCR)[13]进行肠道病毒部分VP1序列扩增，通过序列测定进一步分型。

1.3病毒分离对肠道病毒阳性标本采用人横纹肌肉瘤(RDa)细胞进行病毒分离，参考世界卫生组织《脊髓灰质炎实验室操作手册》[14]第4版肠道病毒分离操作规程操作。病毒株鉴定与标本检测方法相同。

1.4CVA6VP1序列扩增选取CVA6毒株或阳性标本进行VP1全长序列扩增，PCR扩增引物为参考CVA6代表序列通过Primer Premier5.0软件设计获得。引物序列(5′→3′)为：CVA6-VP1-F: TGTGCAAGGACACYGAYGAG，CVA6-VP1-R: AGATGYCGGTTTACCACTCT。采用德国Qiagen公司One-step RT-PCR Kit试剂进行PCR扩增，反应条件为：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min； 95 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 70 s，32个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。采用1.5%琼脂糖凝胶进行特异核酸片段电泳分离。

1.5CVA6序列测序与分析采用美国Affymetrix公司的ExoSAP-IT试剂纯化PCR产物，测序反应试剂和测序反应产物纯化试剂分别采用美国ABI公司的BigDye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit试剂和BigDye X-terminator试剂，应用ABI3100全自动遗传分析仪进行测序分析。对于获取的CVA6原始序列采用DNAStar6.0、MEGA5.2等软件进行序列拼接、整理、分析并构建VP1全长序列系统进化树。用于序列分析的国内外CVA6参比序列下载自GenBank。

1.6统计学方法采用统计软件SPSS18.0建立数据库，对检测数据进行统计分析。组间比较运用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1病例基本信息123例疱疹性咽峡炎病例中，男性病例101例，女性病例22例，男女比例为4.6∶1，均为轻症病例，发病年龄最小为19 d，最大为25岁，中位数为1.42(0.05，25)岁。收集的病例为5至8月份病例，以7月份病例为主，占53.66%(66/123)。

2.2病例病原构成运用荧光定量PCR和Sn-PCR，对收检的123例疱疹性咽峡炎病例的211份标本进行肠道病毒检测及分型鉴定，粪便标本和咽拭子标本其中之一检测阳性则表示该病例为阳性。经检测，共检出115例病例为肠道病毒阳性，阳性率为93.50% (115/123)，其中CVA6阳性率为60.98% (75/123)，CVA10阳性率为13.01% (16/123)，CVA2阳性率为4.88% (6/123)，EV71阳性率为4.88% (6/123)，CVB2和Echo30阳性各1例，6例病例为两种肠道病毒混合感染，分别为CVA2/CVA10、CVA2/Echo14、CVA2/EV71、CVA6/CVA10、CVA6/CVA16和CVA6/EV71，另有4例肠道病毒阳性病例未能成功分型。

表1 粪便标本与咽拭子标本肠道病毒检出率比较

2.3病毒分离与鉴定对115例病例的176份肠道病毒阳性标本采用RDa细胞进行病毒分离，共从17例病例18份标本中分离获得肠道病毒毒株18株，阳性分离率为10.23% (18/176)。经鉴定，7株为CVA10，4株为CVA6，3株为CVA2，2株为EV71，有2株为混合毒株，分别为CVA2/Echo14和CVA6/CVA10。

2.4不同标本检出率经荧光定量PCR检测结果统计，粪便标本肠道病毒阳性率为98.02% (99/101)，平均Ct值为23.70；咽拭子标本肠道病毒阳性率为70.00% (77/110)，平均Ct值为31.47。粪便与咽拭子标本PCR肠道病毒检出率差别有统计学意义(χ2=29.88,P<0.01)。对176份肠道病毒阳性标本进行病毒分离，其中粪便标本肠道病毒分离阳性率为16.16% (16/99)，咽拭子标本肠道病毒分离阳性率为2.60% (2/77)。统计分析发现，粪便与咽拭子标本肠道病毒分离阳性率差别有统计学意义(χ2=8.67,P<0.01)。详见表1。

2.5CVA6遗传进化分析本研究共从不同病例的3株CVA6毒株和6份CVA6阳性标本获得9条CVA6病毒VP1全长序列。为了解2015年广州地区疱疹性咽峡炎优势病原体CVA6病毒的遗传进化情况，将获得的9条CVA6病毒VP1全长序列进行序列同源性分析并与57条CVA6参比序列构建系统进化树。参比序列包括了20条广东省手足口病监测病例序列、6条2004—2007年广东省急性弛缓性麻痹(AFP)监测病例序列和31条下载自GenBank的部分国家或地区及国内城市的代表序列。

同源性分析显示，本研究的9条CVA6病毒VP1全长序列核苷酸同源性96.9%～99.9%，氨基酸同源性99.0%～100.0%，与CVA6原型株Gdula的核苷酸同源性82.6%～83.3%，氨基酸同源性94.8%～95.7%。构建系统进化树发现， CVA6可分为A、B、C、D等4个基因型，其中D基因型包括了D1、D2、D3等3个基因亚型，与相关文献肠道病毒的分型相同[15]。2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6病毒株在系统进化树中处于较为集中的一簇，同源性高，与2012年上海流行株(KC414740)、2015年深圳地区引起疱疹性咽峡炎的CVA6流行株(KU844071、KU844078)和广东省手足口病2015年大部分CVA6流行株及2013年流行株(HFMD839)在系统进化树中处于同一分支，均属于D3基因亚型。另外，2008年西班牙、2010年法国、2009—2011年中国台湾和日本的部分流行株也属于D3基因亚型，与2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6流行株亲缘关系较近。2004—2007年广东省AFP病例的6株CVA6分离株在进化树处于B和D2两个分支中，分别属于B基因型或D2基因亚型，与2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6流行株的亲缘关系较远。详见图1。

注：●2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6流行株；▲2015年广东省手足口病CVA6流行株图1 2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6 VP1全长序列系统进化树Note: ●Guangzhou strains of herpangina in 2015; ▲Guangdong strains of hand-foot-mouth disease in 2015Fig.1 Phylogenetic tree of the entire VP1 of CVA6 from herpangina cases of Guangzhou in 2015

3 讨论

疱疹性咽峡炎常引起聚集性疫情的发生，对儿童的身心健康可造成严重影响。2009年10月巴西亚马逊地区出现了疱疹性咽峡炎疫情，共44个患者，以1～9岁儿童为主[6]；2012年泰国暴发一起疱疹性咽峡炎疫情，共166个患者，以1岁组儿童为主，7月份疫情最为严重[1]。国内江苏等6省市近几年接连报道疱疹性咽峡炎流行[5, 8-12]，引起社会各界广泛关注。加强疱疹性咽峡炎监测对于婴幼儿童的健康具有重要意义。

本研究对于2015年广州地区的疱疹性咽峡炎病例监测发现，病例均为轻症，男性多于女性，发病年龄以1岁左右婴幼儿为主，病例主要集中在7月份，与其他报道相符[1]。病原学检测发现，检出CVA6、CVA10、CVA2、CVA16、CVB2、EV71、Echo14和Echo30等8种肠道病毒，其中阳性率前3位的病原体分别为CVA6(60.98%)、CVA10(13.01%)、CVA2(4.88%)和EV71(4.88%)，表明2015年广州地区疱疹性咽峡炎主要由肠道病毒A组的柯萨奇病毒引起，其中CVA6为优势病原。另外，有6例病例同时检出两种肠道病毒，提示肠道病毒共同感染可能是一种普遍现象。在国内，2015年东莞市和杭州市报道引起疱疹性咽峡炎的优势病原体为CVA2，2015年深圳市报道主要流行病原体为CVA6，江苏省报道2013—2014年疱疹性咽峡炎主要病原体为EV71(10.5%)，长春市2012和2013年的主要流行病原分别为CVA10和CVA6[5,8,10-12]。在国外，2009年巴西亚马逊地区暴发肠道病毒B群引起的疱疹性咽峡炎疫情[6]，2010年法国报道CVA6和CVA10为主要流行株的疱疹性咽峡炎和手足口病疫情暴发[7]，2012年泰国发生了以CVA8和CVA6为主要病原的疱疹性咽峡炎疫情[1]。以上数据表明，国内外疱疹性咽峡炎的优势病原体以柯萨奇A组病毒较为常见，但不同时间、不同地区流行的病原体种类可能不同。

比较疱疹性咽峡炎病例不同类型标本的肠道病毒检出率发现，在荧光定量PCR和病毒分离两种方法检测中粪便标本的肠道病毒检出率均高于咽拭子标本。因此，粪便标本在疱疹性咽峡炎病原检测中优于咽拭子标本。然而，咽拭子标本的检测对于疱疹性咽峡炎病例的实验室确诊也具有较高的临床意义。建议对于疱疹性咽峡炎病例应同时采集粪便和咽拭子标本进行病原学检测。另外，本研究中荧光定量PCR与病毒分离两种检测方法对于肠道病毒的检出率差异较大，推测可能与采集的咽拭子标本病毒含量偏低及病毒分离只选择RDa一种细胞系有关。

近年来CVA6已成为引起手足口病的主要病原体之一，在2013年CVA6更是取代了EV71和CVA16成为国内部分城市的优势病原体[15]。因此，CVA6的分子流行病学研究越来越受到关注和重视。本研究选取9条CVA6病毒VP1全长序列与57条国内外参比序列进行系统进化分析发现，CVA6可分为A、B、C、D等4个基因型，其中D基因型可分为D1、D2、D3等3个基因亚型，与相关文献报道相符[15]。2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6流行株同源性高，与原型株Gdula的亲缘关系较远，而与2012年上海市部分流行株、2015年深圳市疱疹性咽峡炎流行株和2015年广东省手足口病大部分CVA6流行株的亲缘关系较近，均属于D3基因亚型。较有意义的是，引起2015年广州地区疱疹性咽峡炎与广东省手足口病的CVA6流行株在系统进化树处于同一簇，同源性高，提示二者具有共同的致病原。因此，加强疱疹性咽峡炎的病原监测也可为手足口病的防控提供相关参考数据。另外，部分国家或地区的CVA6流行株也属于D3基因亚型，与2015年广州流行株亲缘关系较近，提示与广东省2015年CVA6流行株可能具有共同的进化来源。广东省2004—2007年AFP监测病例CVA6毒株属于B基因型或D2基因亚型，与2015年广州地区疱疹性咽峡炎CVA6流行株基因型不同，亲缘关系较远。引起二者的CVA6病毒亲缘关系较远，可能与病毒随着时间的推移持续进化相关，是否CVA6的B基因型或D2基因亚型更易引起AFP的发生，亟待对两种疾病在同一时期的CVA6病毒作比对研究。本研究通过对疱疹性咽峡炎的病原学特征分析，阐明了2015年广东省广州地区疱疹性咽峡炎的病原学特征，进一步证实疱疹性咽峡炎与手足口病的发病趋势相近，且二者的病原体大部分一致，为疱疹性咽峡炎病原变化规律的深入研究及防控策略的制订提供了一定的病原学数据。

[1] Puenpa J, Mauleekoonphairoj J, Linsuwanon P, et al.Prevalence and characterization of enterovirus infections among pediatric patients with hand foot mouth disease, herpangina and influenza like illness in Thailand, 2012[J]. PLoS One, 2014, 9(6): e98888. doi: 10.1371/journal.pone.0098888.

[2] Chen KT, Chang HL, Wang ST, et al.Epidemiologic features of hand-foot-mouth disease and herpangina caused by enterovirus 71 in Taiwan, 1998-2005[J]. Pediatrics, 2007, 120(2): e244-252.doi: 10.1542/peds.2006-3331.

[3] 贺锦晔, 赵小红, 马利维, 等. 118例疱疹性咽峡炎患儿心肌损伤临床分析[J]. 检验医学与临床, 2012, 9(19):2442-2443.doi:10.3969/j.issn.1672-9455.2012.19.024.

[4] 王宏宇, 张小爱, 许红梅, 等. 手足口病患者不同标本中肠道病毒检测结果比较[J]. 中华疾病控制杂志, 2014, 18(6):501-503.

[5] 许爽, 刘金香, 吴东林, 等. 长春地区儿童疱疹性咽峡炎病原研究[J]. 中国卫生检验杂志, 2016, 26(3):391-393.

[6] Oliveira DB, Campos RK, Soares MS, et al. Outbreak of herpangina in the Brazilian Amazon in 2009 caused by Enterovirus B[J].Arch Virol, 2014, 159(5):1155-1157. doi: 10.1007/s00705-013-1858-5.

[7] A.Mirand, C.Henquell, C.Archimbaud, et al. Outbreak of hand, foot and mouth disease/herpangina associated with coxsackievirus A6 and A10 infections in 2010, France: a large citywide, prospective observational study[J]. Clin Microbiol Infect, 2012, 18(5): E110-118. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03789.x.

[8] Yao X, Bian LL, Lu WW,et al. Epidemiological and etiological characteristics of herpangina and hand foot mouth diseases in Jiangsu, China, 2013-2014[J]. Hum Vaccin Immunother, 2017, 13(4): 823-830. doi: 10.1080/21645515.2016.1236879.

[9] 李佳萌, 李琳, 吕莉琨, 等. 2014年天津市肠道病毒所致疱疹性咽峡炎临床流行病学分析[J]. 中华疾病控制杂志, 2016, 20(1):26-29.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2016.01.007.

[10] 王玉洁, 杨洪, 姚相杰, 等. 2015年深圳地区疱疹性咽峡炎的病原学与流行病学特征分析[J]. 中华疾病控制杂志, 2016, 20(8):759-763.doi:10.16462/j.cnki.zhjbkz.2016.08.002.

[11] Peng Q, Xie M, Zhang Y, et al. Molecular epidemiology of the enteroviruses associated with hand, foot and mouth disease/herpangina in Dongguan, China, 2015[J]. Arch Virol, 2016, 161(12):3463-3471.doi: 10.1007/s00705-016-3058-6.

[12] Li W, Gao HH, Zhang Q, et al. Large outbreak of herpangina in children caused by entero- virus in summer of 2015 in Hangzhou, China[J]. Sci Rep, 2016, 6:35388. doi: 10.1038/srep35388.

[13] Nix WA, Oberste MS, Pallanch MA. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original specimens[J]. J Clin Microbiol, 2006, 44(8): 2698-2704. doi: 10.1128/JCM.00542-06.

[14] 世界卫生组织. 脊髓灰质炎实验手册[M].4版. 北京: 中国疾病预防控制中心, 2004: 78-96.

[15] 曾汉日, 陆靖, 李晖, 等. 广东省2008-2013年柯萨奇A6型肠道病毒的流行及其基因特征分析[J]. 中华微生物和免疫学杂志, 2014, 34(10):742-746. doi:10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2014.10.003.

2017-05-19)

(本文编辑：吕新军)

EtiologicalcharacteristicsofherpanginacasesinGuangzhoucityinGuangdongprovince,2015

ZengHanri,ZhengHuanying,LiuLeng,LuJing,TanXiaohua,SunLimei,FangLing,LiHui,KeChangwen.

GuangdongProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention, 511430Guangzhou,China(ZengHR,ZhengHY,LiuL,TanXH,SunLM,FangL,LiH,KeCW);GuangdongProvincialInstituteofPublicHealth, 511430Guangzhou,China(LuJ)

LiHui,Email:gdcdclihui@163.com

ObjectiveTo analyze the etiological of herpangina(HA) in Guangzhou City in 2015, and to provide laboratory data for the epidemic control.MethodsTwo hundred and eleven herpangina samples (stool and throat swab) were collected.Real-time (RT)-PCR and semi-nested (Sn)-PCR assays were performed to detect human enteroviruses (HEVs)-positive samples. The human rhabdomyosarcoma (RDa) cell lines were used to inoculate virus from HEVs-positive samples. The entire sequences of viral genes encoding VP1 of CVA6 positive samples or strains were amplified and sequenced. The phylogenetic analysis was performed to analyze the full-length gene sequences encoding VP1 of CVA6 by using DNAStar6.0 and MEGA5.2 software packages.ResultsAccording to the laboratory test results, 115 cases were HEVs-positive and positive rate was 93.50%,eight serotypes of EV including CVA6, CVA10, CVA2, EV71, CVA16, CVB2, Echo14 and Echo30 were detected.The CVA6 positive rate was the highest with a percentage of 60.98%, followed by CVA10 with a percentage of 13.01%. The enterovirus positive rate of stool samples (χ2=29.88,P<0.01) and viruses isolated positive rate (χ2=8.67,P<0.01) were higher than that in throat swab samples. Phylogenetic analysis showed that all CVA6 strains detected in this study belonged to D3 subgenotype, and shared 96.9%-99.9% homologies in nucleotide and 99.0%-100.0% in amino acid.ConclusionsCVA6 of the enterovirus A group accounted for the main pathogen of herpangina in Guangzhou City in Guangdong province in 2015,which belonged to D3 subgenotype.

Herpangina; Enterovirus; CVA6; Phylogenetic analysis

李晖，Email:gdcdclihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.007

疱疹性咽峡炎；肠道病毒；CVA6；系统进化分析

广东省省级科技计划项目(2014A020212243)；广东省自然科学基金项目(2015A030310013)

FundprogramsScience and Technology Planning Project of Guangdong Province (2014A020212243);National Natural Science Foundation of Guangdong, China(2014A020212243)