董佩 李楠 何于雯 徐天刚 殷建忠 王静林

650500 昆明医科大学公共卫生学院(董佩、殷建忠)；650224 昆明，云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒重点实验室(李楠、何于雯、王静林)；266032 青岛，中国动物卫生与流行病学中心 (徐天刚)

库蠓中盖塔病毒的分离及其分子鉴定

董佩 李楠 何于雯 徐天刚 殷建忠 王静林

650500 昆明医科大学公共卫生学院(董佩、殷建忠)；650224 昆明，云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒重点实验室(李楠、何于雯、王静林)；266032 青岛，中国动物卫生与流行病学中心 (徐天刚)

目的探讨1株(SZC30)云南省库蠓分离病毒的分类及分子特征。方法2013年7月采用灯诱的方法在云南省曲靖市师宗县五龙乡采集库蠓，采用BHK-21和C6/36细胞进行病毒分离，阳性分离物脑内接种1日龄乳鼠；分别用甲病毒属和盖塔病毒特异性引物对阳性分离物进行RT-P C R扩增、测序，用Clustal X1.83、BioEdit、DNAStar、 Mega5.1等生物信息学软件进行序列分析。结果采集到库蠓共3 500只，库蠓分为41批进行病毒分离，其中分离到一株病毒(SZC30)对BHK-21与C6/36细胞产生明显病变；分别用甲病毒属和盖塔病毒NS1特异性引物进行RT-P C R扩增结果为阳性；NS1基因序列分析结果显示SZC30株病毒与YN0540及SC1210两株中国分离的盖塔病毒位于同一进化分支内，核苷酸同源性在97%～100 %之间，氨基酸同源性在97%～100%之间。结论从云南省采集库蠓中分离到的SZC30株病毒为盖塔病毒。

盖塔病毒(Getah virus, GETV)属于披膜病毒科甲病毒属，为单股正链RNA病毒。该病毒感染猪、马等家畜动物，能引起感染动物出现发热、发疹、浮肿、后肢麻痹、精神不振等症状，严重者可致死亡[1]；此外猪妊娠前期感染可导致胚胎死亡、产死胎等[2]，给养殖业造成严重的经济损失。血清学调查结果显示在人和其它多种动物检测到GETV抗体[3-4]，证明了人和多种动物存在GETV感染[5]。1955年在马来西亚橡胶园中的雪背库蚊中首次分离到GETV[6]，随后在东亚、东南亚、欧洲的东部以及大洋洲北部的蚊虫也分离到GETV[7-8]。国内在1964年海南省采集的蚊虫中分离到第一株GETV(M1)，随后在河南、陕西、云南等地采集的蚊虫标本中分离到多株GETV。迄今为止，国内外还未见从蚊虫以外其他媒介标本中分离到GETV的报道。2013年7月本研究在云南省曲靖市师宗县采集的库蠓标本中分离到1株病毒，并对该株病毒进行了分子鉴定，现报道如下：

1 材料与方法

1.1蚊虫采集2013年7月在云南省曲靖市师宗县五龙乡民房附近的猪圈、牛圈和鸡圈采集库蠓标本，在下午19:00至次日早晨7:00采用诱蚊灯(12 V; 300 mA; Wuhan Lucky Star Environmental ProtectionTech Co., Ltd., Hubei, China)捕捉蠓虫，次日清晨放入-20 ℃冰箱，20 min后取出，根据蠓虫形态学特征在解剖镜下进行库蠓鉴定，库蠓未进行具体种类鉴定。每管50～100只分装，编号登记迅速置于液氮罐中带回实验室。

1.2病毒分离从液氮中取出库蠓加1 ml细胞维持液[含2%青、链霉素(10 000U/L)双抗、1%的谷氨酰胺]进行研磨，4 ℃、16 000×g离心10 min。取150 μl研磨液上清接种生长至70%～80%的单层C6/36和BHK-21细胞，分别放入28 ℃和37 ℃恒温箱中吸附，1 h后弃上清，加1 ml维持液放入恒温箱继续培养。每日观察细胞病变(Cytopathic effect, CPE)情况，每代连续观察7 d，连续盲传3代，有病变者继续传代至出现规律病变。阳性分离物细胞培养上清30 μl/只进行乳鼠脑内接种毒力实验，观察记录乳鼠病变死亡情况。

1.3RNA提取及cDNA合成取阳性分离物200 μl，采用RNAiso Plus(TaKaRa公司，大连宝生物工程有限公司)按照试剂盒说明书进行总RNA提取，-80 ℃保存。用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒(TaKaRa公司，大连宝生物工程有限公司)按照说明书合成cDNA第一链。

1.4PCR扩增分别采用甲病毒属特异性引物M2W(引物序列5′YAG AGC DTT TTC GCA YST RGC HW3′)、cM3W(引物序列5′ACA TRA ANK GNG TNG TRT CRA ANC CDA YCC3′)[9]及GETV NS1基因特异性引物GETV1F(5′CGT TTC CCG CCT TTG AG3′)/GETV1R(5′GTT TGT GTT TCT TTG CGT CCT ACC3′)[10]进行PCR扩增；PCR扩增体系为25 μl，即2 μl cDNA、12.5 μl 2×T5 Super PCR Mix、0.5 μl上下游引物、9.5 μl RNase-free ddH2O，扩增条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃30 s，57.2 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，送昆明硕擎生物公司进行测序。

1.5序列分析在GenBank中下载所有GETV NS1基因序列与库蠓新分离病毒相应的序列进行比对、核苷酸和氨基酸同源性分析及遗传进化分析。具体分析如下：使用DNAStar 软件中SeqMan进行序列拼接，用Clustal X1.83软件进行病毒基因序列和推测的氨基酸序列的比对,使用DNAStar软件进行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析，用Mega5.1软件绘制基于Neighbor-joining(NJ)方法构建系统进化树，Bootstrap值为1 000。

2 结果

2.1病毒分离2013年7月在云南省曲靖市师宗县五龙乡猪圈、牛圈以及鸡圈共采集库蠓3 500只，库蠓分41批进行病毒分离，其中一株病毒(SZC30)对BHK-21和C6/36细胞产生明显的病变，BHK-21细胞病变时间为1 d，细胞病变特点为产生明显的变圆、肿胀、脱落，C6/36细胞病变时间为3 d，细胞病变特点为出现细胞圆缩、脱落、碎裂。将病毒脑内接种乳鼠，2～3 d出现食欲不振、震颤、抽搐等中枢神经系统症状，最后乳鼠死亡。

2.2病毒鉴定采用披膜病毒科甲病毒特异性引物进行RT-PCR扩增，结果SZC30在430 bp处扩增出特异性条带，提示该病毒可能为甲病毒。序列测定，获得430 bp核酸序列，经Blast比对SZC30与盖塔病毒KorS1010株核苷酸同源性最高，为100%，初步鉴定该库蠓分离病毒为GETV。

表1 SZC30核苷酸与氨基酸序列同源性分析

注：右上方为核苷酸序列同源性， 左下方为氨基酸序列同源性分析

Note：The upper right is nucleotide sequence homology, the lower left is amino acid sequence homology

2.3GETVNS1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析选取中国3株GETV(分别为海南省M1株、四川省SC1210株、云南省YN0540株)、马来西亚1株(MM2021株)、韩国1株(KorS1010株)及俄罗斯1株(LEIV 16275 Mag株)与库蠓分离病毒株(SZC30)进行核苷酸与氨基酸序列同源性分析(见表1)，SZC30与甲病毒属GETV同源性最高，和国内外其他GETV分离株核苷酸与氨基酸的同源性同为97%～100%。其中与马来西亚原始株MM2021核苷酸同源性最低为97%，与海南分离株M1氨基酸同源性最低为97%，与韩国分离株KorS1010核苷酸与氨基酸同源性皆达到100%。

2.4GETVNS1系统进化分析下载GenBank中国分离株M1、YN0540、SC1210等11株GETV及1株甲病毒属基孔肯雅病毒(CHIKV)S27-African prototype的NS1基因序列，与库蠓分离SZC30株病毒 NS1核苷酸序列一起构建系统进化树(见图1)，新分离株SZC30与11株GETV病毒位于同一进化分支内；进一步分析结果显示库蠓分离病毒SZC30株与2005年中国GETV分离株YN0540及2012年中国GETV分离株SC1210位于同一小的进化分支内，表明它们亲缘关系较近。

注：毒株标识从左到右为病毒种类、编号、宿主及基因序列号；▲ 为本研究分离病毒株图1 库蠓分离的盖塔病毒NS1遗传进化分析Note: Markers of virus strains from left to right are species, code, host and gene sequence number; ▲ indicates the virus isolate in this studyFlg. 1 Phylogenctic analysis of NS1 gene of Getah virus irus isolated from Culicoides

3 讨论

本次在云南省师宗县五龙乡采集的库蠓中分离到的SZC30病毒能引起BHK21和C6/36细胞产生明显的细胞病变，在BHK-21细胞上病变较为迅速(接种后1 d)，乳鼠脑内接种引起乳鼠发病死亡，这些特点与甲病毒属病毒相似[11]；采用甲病毒属特异引物扩增阳性，这些结果提示该库蠓分离病毒可能为甲病毒属病毒。进一步采用GETV NS1基因特异引物扩增结果为阳性，序列分析结果提示库蠓分离病毒SZC30与国内分离的GETV YN0540及SC1210位于同一进化分支内，核苷酸和氨基酸同源性均高于97%，提示云南库蠓分离病毒SZC30株为GETV，但库蠓是否为GETV的一种新的传播媒介还有待进一步研究。

GETV对马、猪等脊椎动物的影响较大，能够引起马发热、发疹以及猪的繁殖障碍，是一种重要的家畜动物传染病病原体[12]。2005年云南省分离出YN0540和YN0542两株GETV，近几年对云南省德宏州、西部边境等地区进行虫媒病毒调查研究，也分离出多株GETV[13-15]，本研究在云南库蠓中分离到GETV，表明了GETV在云南分布广泛，为云南省动物疫病防控提供科学依据，今后应加强云南省GETV传播媒介种类及相关疫病的研究。

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2017-06-09)

(本文编辑：吕新军)

IsolationandidentificationofGetahvirusfromCulicoidesinYunnan

DongPei,LiNan,HeYuwen,XuTiangang,YinJianzhong,WangJinglin

SchoolofPublicHealth,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China(DongP,YinJZ);YunnanKeyLaboratoryofTropicalandSubtropicalSciencesofYunnanAnimalScienceandVeterinaryInstitute,Kunming650224,China(LiN,HeYW,WangJL);ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter,Qingdao266032,China(XuTG)

WangJinglin,Email:wangjl107@163.com;YinJianzhong,Email:yinjianzhong2005@sina.com

ObjectiveTo discuss the taxonomy and molecular characteristics of one virus strain (SZC30) isolated fromCulicoidesin Yunnan.MethodsCulicoideswere collected with light trap method in the Wulong Village of Shizong County of Yunnan Province in July, 2013. BHK-21 and C6/36 cells were used for virus isolation. The positive isolates were inoculated into brain of one-day suckling mice. Alphavirus and Getah virus specific primers were used to amplify the genome of the virus isolation by RT-PCR. The products of RT-PCR were sequenced. Clustal X1.83, DNAStar, Mega5.1 were used for bioinformatics analysis.ResultsTotally 3 500 culicoides were collected and divided into 41 batches for virus isolation. One isolate (SZC30) produced cytopathic effect (CPE) on BHK-21 and C6/36 cells; the result of RT-PCR with Alphavirus and Getah virus NS1 specific primer were positive; the sequence analysis of NS1 gene suggested that SZC30 and two Getah virus strains (YN0540,SC1210) from China were in the same evolutionary branching, the nucleotide homology were 97%-100%, and the amino acid was 97%-100%.ConclusionsSZC30 isolated in Yunnan province was identified as Getah virus.

Getah virus;Culicoides; Isolation; Identification

王静林，Email: wangjl107@163.com；殷建忠，Email: yinjianzhong2005@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.05.006

盖塔病毒；库蠓；分离；鉴定

国家自然科学基金(31460669)；云南省科技厅青年基金(2014FD075)；国家重点研发计划(2016YFD0500303、2017YFF0210200)

FundprogramsNational Natural Science Foundation(31460669); Yunnan Provincial Science and Technology Department Youth Foundation(2014FD075); National Key Research and Development Projects(2016YFD0500300, 2017YFF0210200)