杨蕊,赵瑞丽,郎剑锋,陆宁海,石明旺

粉红黏帚霉W-21对灰葡萄孢的抑菌活性

杨蕊1,赵瑞丽2,郎剑锋1,陆宁海1,石明旺1

（1.河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003；2.河南科技学院新科学院,河南新乡453003）

为研究粉红黏帚霉W-21菌株对灰葡萄孢的抑菌活性,采用PDA平板和水琼脂对峙培养法测定粉红黏帚霉W-21菌株的抑菌作用,采用扣皿法测定挥发性代谢产物的抑菌作用,采用含毒介质法测定发酵液的抑菌作用,测定了孢子悬浮液对灰葡萄孢菌核萌发的抑制作用.结果表明：灰葡萄孢菌落扩展受到明显抑制,W-21菌株寄生病菌菌丝,导致菌丝细胞原生质体颗粒化、溃解；孢子悬浮液对菌核萌发具有较强的抑制作用,浸泡24 h,菌核萌发率为2.2%；JM发酵液对病菌菌丝生长具有抑制作用,且第9天的抑菌活性最好,菌丝生长抑制率为60%；挥发性代谢产物对灰葡萄孢菌丝生长有一定的影响.

粉红黏帚霉W-21；灰葡萄孢；抑菌活性

黏帚霉（Gliocladium spp.）是一类分布广泛的土壤习居菌,在已知的30多个种中,粉红黏帚霉（G.roseum）、绿色黏帚霉（G.virens）和链孢黏帚霉（G.catenulatum）具有较大的生防潜力.粉红黏帚霉是一类重要的重寄生真菌[1],能够侵染核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）[2]、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）[3]、立枯丝核菌（Rhizoctonia solanii）[4]、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）[5]等多种植物病原真菌.因其具有分布广泛、寄主范围广、寄生能力强及作用机理多样等优点,其生防作用日益受到人们的关注.

灰葡萄孢引起植物灰霉病（gray mould disease）,其寄主广泛,危害葡萄、蔬菜、瓜果以及观赏性植物等多种植物,造成巨大的经济损失[6-7].目前,生产上对灰霉病仍采取以化学防治为主的防治对策.由于化学防治所带来的环境污染、农药残留以及病菌抗药性等问题,使得灰霉病的生物防治逐渐引发人们的关注.国外早已有绿黏帚霉（G.virens）链孢黏帚霉（G.catenulatum）（Primasto的商品化制剂问世.虽然粉红黏帚霉极具生防潜力,但由于其货架期和稳定性等问题,至今还无大规模生产和应用.目前,国内大多数处于拮抗菌的筛选、鉴定和室内生测等实验室研究阶段,尚未见商品化制剂的应用报道.W-21菌株分离自被粉红黏帚霉寄生的灰葡萄孢菌核,为研发灰霉病的高效粉红黏帚霉生防制剂,笔者在此前的工作基础上,从W-21菌株对灰葡萄孢菌丝生长、菌核萌发的影响,挥发性代谢产物、发酵液的抑菌活性等方面展开研究,以期探究此菌株的生防机理,评估其生防潜力,为高效生物农药的研发和应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 粉红黏帚霉菌株W-21和番茄灰霉病菌均由河南科技学院植物病理学实验室分离和保存.

1.1.2 培养基 本研究中使用的培养基包括以下4种：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextrose agar,简称PDA）：去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL,121℃灭菌25 min备用.

马铃薯葡萄糖液体培养基（potatodextrosebroth,简称PDB）：马铃薯200g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,121℃灭菌25 min备用.

水琼脂培养基（water agar,简称WA）：琼脂20 g,蒸馏水1 000 mL.

JM液体培养基：淀粉30 g,蛋白胨2 g,蒸馏水1 000 mL.

1.2 试验方法

1.2.1 W-21对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用测定 分别采用PDA平板对峙法和2%水琼脂（WA）玻片对峙法测定W-21对灰葡萄孢菌丝生长的影响.具体方法分别为：PDA平板（直径9 cm）接种新鲜培养的W-21菌饼（直径5 mm）,25℃恒温培养4 d后,接种病菌菌饼（直径5 mm）,菌饼中心相距5 cm,以仅接病菌平板为对照,3次重复.25℃恒温培养3～5 d,逐日观察菌落生长情况并镜检；将少量2%WA倒入放有无菌载玻片的培养皿中,以在载玻片上形成一层水琼脂薄膜为好,待WA冷却凝固后,载玻片一端先接种W-21菌饼（直径5 mm）,25℃恒温培养3 d后,载玻片另一端接种病菌菌饼,6次重复.25℃恒温培养,逐日观察并镜检.

1.2.2 W-21对灰葡萄孢菌核萌发的抑制作用测定 W-21菌株PDA平板培养7 d,无菌水洗脱孢子,血球计数板调节孢子悬浮液至每mL含孢子约1×107个）,将PDA平板培养15 d的病菌菌核置于孢子悬浮液中,分别浸泡0.5、2、24、48和72 h,以无菌水浸泡相应时间为对照,每处理15个菌核,3次重复.分别在设定时间后取出菌核,移植到PDA平板,25℃培养48 h后,取样观察菌核萌发数,计算菌核萌发率.

1.2.3 W-21发酵液的抑菌作用测定 采用含毒介质法测定W-21不同培养基发酵液的抑菌活性.将直径5 mm的W-21菌饼分别接种至JM和PDB液体培养基上,150 r/min、30℃振荡培养6、9和12 d后分别取样,培养物经2层擦镜纸过滤,4 000 r/min离心15 min,上清液分别经0.45 μm、0.22 μm滤膜过滤,收集无菌发酵液,-20℃保存备用.将发酵液以20%比例（V/V）与50℃左右的PDA混合摇匀倒皿,制成含药平板.平板中央接种灰葡萄孢菌饼（直径5 mm）,以无菌水与PDA混合为对照,3次重复.各平板25℃培养48 h后测定病菌菌落直径,计算菌丝生长抑制率.菌丝生长抑制率/%=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100[9].

1.2.4 W-21挥发性代谢产物的抑菌作用测定 采用扣皿法[10],将新鲜培养的W-21菌饼（直径5 mm）接种至PDA平板上,25℃恒温培养,待菌落直径达到5 cm时,在上方盖上双层圆形无菌滤纸（直径10 cm）,再在滤纸上方扣上已接种病菌菌饼的PDA平板（撤去培养皿盖,直径9 cm）,用透明胶带固定密封好.以未接种W-21的PDA平板和只接种病菌的平板对扣处理为对照,3次重复.25℃恒温培养,逐日观察并测量病菌菌落直径.

1.3 数据统计分析

采用SAS 8.0软件中的方差分析程序（ANOVA）分析上述试验处理间的差异显著性.灰葡萄孢萌发百分率和菌丝生长抑制百分率数据在分析之前先进行反正弦转换,变成角度值,分析结束后再将平均值转换成正常的百分率数值.采用Duncan氏新复极差法比较处理之间的差异.

2 结果和分析

2.1 W-21对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用

粉红黏帚霉W-21对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用见图1,对灰葡萄孢的重寄生作用见图2.

图1 粉红黏帚霉W-21对灰葡萄孢菌丝生长的抑制作用Fig.1 Inhibition effect ofGliocladium roseum strain W-21 on the mycelial growth ofBotrytis cinerea

图2 粉红黏帚霉W-21对灰葡萄孢的重寄生作用Fig.2 MycoparasitismofGliocladium roseum strain W-21 toBotrytis cinerea

由图1可知,粉红黏帚霉W-21菌株对灰葡萄孢菌丝生长具有明显的抑制作用,PDA平板对峙培养5 d后,对照病菌菌落平均半径达到55.7 mm,而处理病菌菌落平均半径为28.3 mm,t检验结果表明,处理与对照间存在极显著性差异（P=0.001 6）.由图2的水琼脂玻片对峙结果可知,灰葡萄孢菌落生长受到抑制,产生明显的抑菌带,菌落边缘褐变,且随着培养时间的延长,逐渐被W-21菌株菌落所覆盖.显微观察也发现,W-21对灰葡萄孢具有重寄生作用,其菌丝缠绕寄生灰葡萄孢菌丝.正常灰葡萄孢菌丝质地均匀,而受到W-21作用的灰葡萄孢菌丝出现细胞原生质颗粒化、溃解现象.

2.2 W-21对灰葡萄孢菌核萌发的抑制作用

W-21对灰葡萄孢菌核萌发的抑制效果见图3.

图3 W-21对灰葡萄孢菌核萌发的抑制作用Fig.3 Inhibition effect ofGliocladium roseum strain W-21 on germination ofBotrytis cinerea sclerrotia

由图3可知,W-21菌株分生孢子悬浮液对灰葡萄孢菌核的萌发具有较强的抑制作用.灰葡萄孢菌核经W-21分生孢子液浸泡不同时间后,PDA平板培养48 h观察发现,对照菌核萌发率为100%,而W-21 分生孢子液浸泡 0.5、2、24、48、72 处理,菌核萌发率依次为 100%、66.7%、20%、2.2%、0%、0%.各个处理间存在显著性差异（P＜0.05）；孢子液浸泡2 h与24 h、48 h、72 h处理间差异显著；孢子液浸泡菌核24 h与48 h、72 h处理间无显著差异.W-21分生孢子液浸泡菌核24 h,菌核萌发率仅有2.2%,浸泡48 h以上,菌核不萌发,且随着培养时间的延长,菌核被W-21菌株寄生,腐烂、溃解.

2.3 W-21发酵液的抑菌作用

W-21菌株JM和PDB发酵液对灰葡萄孢抑菌作用测定结果如图4所示：

图4 W-21发酵液对灰葡萄孢菌丝生长的影响（48 h）Fig.4 Effect ofcultural filtrate ofGliocladium roseum strain W-21 on the mycelial growth ofBotrytis cinerea

PDB发酵液的抑菌活性低于JM发酵液.JM培养液培养6、9、12 d的发酵液对灰葡萄孢菌丝生长的抑制率分别为3%、60%、30%,其中发酵9 d的滤液抑菌率最高.PDB培养6、9、12 d的发酵液对灰葡萄孢菌丝生长的抑制率分别为26%、15%、18.6%,其中发酵6 d的滤液抑菌率最高.

2.4 W-21挥发性代谢产物的抑菌作用

W-21挥发性代谢产物抑菌测定结果见表1.

表1 W-21挥发性代谢产物对灰葡萄孢菌丝生长的影响Tab.1 Effect ofvolatile metabolites ofGliocladiumroseumstrain W-21 on the mycelial growth of Botrytis cinerea

由表1可知：共培养1 d,对照灰葡萄孢菌落平均直径为44.7 mm,处理菌落平均直径为24.3 mm,二者之间差异显著；共培养2 d,对照（灰葡萄孢菌落平均直径63 mm）与处理（菌落平均直径57.7 mm）差异不显著；3 d后,无论是对照还是处理平板,灰葡萄孢均已长满平板.这表明W-21挥发性代谢产物对灰葡萄孢菌丝有一定程度的毒害效应,但无致死作用.

3 结论与讨论

营养竞争和重寄生被认为是粉红黏帚霉防治灰霉病的主要机制[10].本试验结果表明,粉红黏帚霉W-21菌株对灰葡萄孢菌丝生长和菌核萌发具有明显的抑制作用.研究中发现,粉红黏帚霉W-21菌株菌落逐步覆盖灰葡萄孢菌落,灰葡萄孢菌丝被W-21菌株菌丝缠绕,导致菌丝生长异常、溃解.W-21孢子悬浮液处理过的灰葡萄孢菌核的萌发受到抑制,且随着处理时间的延长,菌核萌发率明显下降.粉红黏帚霉可以寄生核盘菌菌核,该菌孢子24 h内可侵入大部分核盘菌菌核,导致菌核腐烂溃解[2].本研究中也发现,W-21菌株寄生灰葡萄孢菌核,孢子悬浮液浸泡菌核24 h后,菌核萌发率仅有2.2%.真菌重寄生菌产生葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶等多种细胞壁降解酶作用真菌的细胞壁.粉红黏帚霉寄生核盘菌菌核过程可能涉及多种细胞壁降解酶的参与,葡聚糖酶可能是粉红黏帚霉67-1菌株寄生核盘菌菌核的关键酶[2].粉红黏帚霉W-21菌株寄生灰葡萄孢菌核过程,是否存在多种细胞壁降解酶的作用,还有待于进一步研究确认.

粉红黏帚霉还可以通过抗菌物质来抑制灰霉病的发生.本研究中发现,W-21不同培养基发酵液影响抗菌物质的产生,JM培养物滤液的抑菌活性高于PDB培养物滤液.W-21发酵液抑菌活性成分以及最佳发酵条件,还有待于做进一步的研究.W-21菌株挥发性代谢产物对灰葡萄孢菌丝生长具有不稳定的抑制作用,挥发性代谢产物虽对灰葡萄孢菌丝的生长有一定的影响,但最终无法抑制菌落的扩展.

粉红黏帚霉W-21菌株对灰葡萄孢菌丝和菌核具有较强的重寄生作用,发酵液、挥发性代谢产物也具有抑菌活性,这说明W-21对灰葡萄孢引起的灰霉病具有良好的生防潜力.今后,将进一步展开W-21菌株防病效果的测定以及在自然界中的消长动态,为W-21菌株生防制剂的研发和推广应用提供理论依据.

[1]SCHROERS H J,SAMUELS G J,SEIFERT K A,et al.Classification of the mycoparasite Gliocladium roseum in Clonostachys as C.rosea,its relationship toBionectria ochroleuca,and notes on other Gliocladium-like fungi[J].Mycologia,1999,91（2）：365-385.

[2]张拥华,高会兰,马桂珍,等.粉红黏帚霉67-1菌株寄生核盘菌研究[J].植物病理学报,2004,34（3）：211-214.

[3]杨蕊,郎剑锋,陆宁海,等.粉红黏帚霉对玉米茎基腐病的抑菌防病作用[J].河南科技学院学报（自然科学版）,2016,44（5）：28-33.

[4]马桂珍,王淑芳,暴增海,等.粉红黏帚霉67-1菌株对水稻纹枯病的抑菌防病作用研究[J].作物杂志,2011（6）：77-80.

[5]赵士振.粉红黏帚霉防治果蔬灰霉病的研究[D].武汉：华中农业大学,2015：3-5.

[6]WILLIAMSON B,TUDZYNSKI B,TUDZYNSKI P,et al.Botrytis cinerea：The cause of grey mould disease[J].Molecular Plant Pathology,2007,8（5）：561-580.

[7]白晓蒙,静大鹏,李双民,等.不同培养条件对秦皇岛地区葡萄灰霉病菌菌丝生长的影响[J].河北科技师范学院学报,2016,30（1）：30-34.

[8]郑锦.绿色黏帚霉对玉米大斑病生物防治研究[D].雅安：四川农业大学,2011：10.

[9]王秀平,齐慧霞,温晓蕾.氧化石墨烯对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和炭疽病菌（Colletortrichum gloeosporioides）的离体抑菌活性[J].河北科技师范学院学报,2016,30（3）：45-48,54.

[10]NOBRE S A M,MAFFIA L A,MIZUBUTI E S G,et al.Selection of Clonostachys rosea isolates from Brazilian ecosystems evective in controllingBotrytis cinerea[J].Biological Control,2005,34（2）：132-143.

Antifungal activities of Gliocladium roseum strain W-21 to Botrytis cinerea

YANG Rui1,ZHAO Ruili2,LANG Jianfeng1,LU Ninghai1,SHI Mingwang1
（1.School ofResources and Environmental Sciences,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；2.Xinke College,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang 453003,China）

The purpose of this study was to evaluate the antifungal activities of Gliocladium roseum strain W-21 to Botrytis cinerea.Confrontation culture in PDA and WA plate were used to test the inhibitory effect of W-21 on mycelial growth of B.cinerea.Dish buckle and toxic media was used to test the inhibitory effect of volatile metabolites and cultural filtrates,respectively.Conidia suspension was used to test the inhibitory effect on germination of sclerotia.The results showed that the colony expansion of B.cinerea was inhibited in confrontation culture plates,and the hyphae were parasitized by W-21.The inhibited mycelia of B.cinerea showed severe abnormal symptoms including cytoplasma granulation and outward leakage,cellular swelling and collapse.The germination of sclerotia was significantly suppressed by conidia suspension of W-21,after incubation for 24 h,the rate was only 2.2%.Volatile metabolites had some inhibitory effect on mycelial growth of B.cinerea.The mycelial growth of B.cinerea were suppressed by the JM cultural filtrate,especially on 9th day,mycelial growth inhibition rate was 60%.

Gliocladium roseum strain W-21；Botrytis cinerea；antifungal activities

S476

A

1008-7516（2017）05-0032-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.05.006

2017-09-30

河南省教育厅高等学校重点科研项目（17A210006）

杨蕊（1980—）,女,河南新乡人,硕士,讲师.主要从事植物病害生物防治方面的研究.

（责任编辑：邓天福）