张雪，黄雷，阮进学，刘志国，程英，冯书堂，牟玉莲，李奎



PCSK9基因突变体转基因猪的制备与分析

张雪，黄雷，阮进学，刘志国，程英，冯书堂，牟玉莲，李奎

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193）

【】前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proprotein convertase subtilisin/Kexin type 9，）基因是人类高胆固醇血症（autosomal dominant hypercholesterolemia, ADH）的主效基因之一，其获得型突变与人类家族性高胆固醇血症有直接的关系。PCSK9-D374Y突变体对低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR）的降解能力比野生型蛋白强十倍，增加了患高胆固醇血症的风险，从而加速动脉粥样硬化的进程。猪心血管系统和血脂代谢方面与人类非常相近，成为研究动脉粥样硬化疾病的理想模型之一。然而自然发病的猪缺乏，且诱导病征发生缓慢。因此拟利用体细胞克隆技术制备获得型突变体转基因猪，以模拟动脉血管的病理学变化，加速发病进程，为动脉粥样硬化的研究提供理想的动物模型。【】研究使用人PCSK9基因突变体载体，用电转染的方法将其整合到五指山小型猪近交系胎儿成纤维细胞中，并通过体细胞核移植技术获得了人PCSK9基因突变体转基因猪个体。通过Southern-blot、实时荧光定量PCR、Western-blot等方法，分别从DNA、RNA、蛋白的水平检测了人PCSK9基因在转基因猪肝脏中的整合表达情况。同时，通过组织化学染色与H.E.染色的方法对转基因猪进行了组织学检测。【】转基因阳性细胞集落在药筛的第3天开始出现，至第7天形成较大的单克隆点，且PCR检测结果显示扩增产物可以拼接为完整片段，说明外源片段在基因组中具有完整性；……