(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

2017-08-03

福建省科技计划社会发展引导性(重点)项目(2016Y0004).

牛曰华(1981-)，男，工程师，主要从事水产品质量安全和渔业生态环境检测.E-mail：yhniu99@126.com

牛曰华.全自动固相萃取-超高效液相色谱法测定淡水养殖水体中的呋喃丹[J].渔业研究，2017，39(5)：386-391.

全自动固相萃取-超高效液相色谱法测定淡水养殖水体中的呋喃丹

牛曰华

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建 福州 350003)

本文建立了淡水养殖水体中呋喃丹的全自动固相萃取-超高效液相色谱检测方法。选取HLB固相萃取小柱作为水样的富集和净化小柱，水样以5 mL·min-1的速度上样，用10 mL甲醇洗脱。洗脱液经浓缩、定容后，采用超高效液相色谱-荧光检测法分析，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，粒径1.7 μm)，流动相为乙腈-水(40∶60，V/V)，流速为0.200 mL·min-1，激发波长为270 nm，发射波长为310 nm。呋喃丹在20～1 000 μg·L-1范围内线性关系良好，相关系数R2> 0.999，方法检出限为0.100 μg·L-1，定量限为0.250 μg·L-1，在0.250、2.50、10.0 μg·L-1三种加标浓度水平下，平均加标回收率为90.4%～96.3%，相对标准偏差为2.55%～5.10%。该方法自动化程度高、操作简便、快速准确、稳定性好，适用于淡水养殖水体中呋喃丹的测定。

呋喃丹；超高效液相色谱；全自动固相萃取；淡水养殖水体

呋喃丹(Carbofuran，又名克百威)是一种氨基甲酸酯类杀虫剂，属高毒农药，可在棉花、大豆和水稻等农作物上使用[1]。由于使用范围较为广泛，并且具有一定的水溶性，呋喃丹在农田土壤中残留期较长，也可通过降水和地表径流等途径迁移至水体中，从而造成池塘、水库等水体的污染。随着工农业的发展，环境污染正逐渐成为影响食品安全的重要因素之一，为保证淡水养殖产地环境安全和农产品质量安全，NY/T 5361—2016《无公害农产品 淡水养殖产地环境条件》[2]增加了呋喃丹的检测指标，规定其在淡水养殖水体中的最大限量值为0.01 mg·L-1。

目前呋喃丹的检测方法主要有液相色谱-柱后衍生荧光检测法[3-6]、液相色谱-紫外检测法[7-12]、液相色谱串联质谱法[13-16]、气相色谱-质谱法[17]等。其中NY/T 5361—2016《无公害农产品 淡水养殖产地环境条件》中推荐的呋喃丹的检测方法参照GB/T 5750.9—2006《生活饮用水标准检验方法 农药指标》[18]的相关规定，该方法选用传统的液液萃取方式进行提取，然后采用高效液相色谱-柱后衍生荧光检测法进行测定，但液液萃取需要消耗大量的有机试剂，工作量较大，柱后衍生荧光检测法需要专门配备柱后衍生装置，操作较为繁琐，结果的稳定性较差，同时所用衍生剂毒性较大。而其他的检测方法中，液相色谱串联质谱法和气相色谱-质谱法检测成本较高，液相色谱-紫外检测法灵敏度较低。

全自动固相萃取操作简便，自动化程度高，样品前处理全程可以做到无人值守，可按照设定的程序自动完成固相萃取柱活化、样品上样、淋洗、洗脱和浓缩等工作，并能精确控制上样速度、洗脱体积、氮吹温度、氮气流速等各种参数，从而减少手动操作带来的误差，并且缩短了样品前处理时间，显著提高了检测结果的稳定性和检测工作效率。荧光检测器灵敏度高，适用于痕量分析。基于全自动固相萃取技术和荧光检测器的上述优点，本文选用全自动固相萃取对养殖水体中的呋喃丹进行富集、净化和浓缩，然后根据呋喃丹自身的荧光特征，用超高效液相色谱-荧光检测法进行检测。该方法样品前处理自动化程度高，测定时无需柱后衍生操作，方法简便快速，灵敏度和准确度较高，稳定性好，可有效满足淡水养殖水体中呋喃丹的检测要求。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters H-CLASS超高效液相色谱仪，配荧光检测器；Fotector-06C全自动固相萃取仪(厦门睿科仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；MS3涡旋混合器(德国IKA公司)；超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。

呋喃丹标准品(100 μg·mL-1溶于甲醇)；甲醇、乙腈(色谱纯，Merck公司)；Waters HLB固相萃取小柱(60 mg，3 mL)；Waters C18固相萃取小柱(500 mg，6 mL)。

1.2标准溶液的配制

移取适量的呋喃丹标准品，用乙腈-水(40∶60，V/V)溶液稀释成浓度分别为20、50、100、250、500、1 000 μg·L-1的标准使用液，于冰箱中4℃保存。

1.3样品前处理

量取200 mL经0.45 μm滤膜过滤的水样，转移至全自动固相萃取仪的进样瓶中。将HLB小柱和洗脱液收集管分别安装在全自动固相萃取仪上。仪器运行程序如表1所示，对水样进行富集、净化和浓缩，运行结束后，取出氮吹干的收集管，用1.00 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜后用超高效液相色谱检测。

表1 全自动固相萃取程序

1.4色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，粒径1.7 μm)；流动相为乙腈-水(40∶60，V/V)，流速0.200 mL·min-1；柱温40℃；进样量10.0 μL；检测波长：激发波长为270 nm，发射波长为310 nm。

2 结果与讨论

2.1检测器和检测波长的选择

紫外检测器和荧光检测器是液相色谱分析中常用的两种检测器。荧光检测器选择性较强，主要适用于在紫外光的照射下可以发出荧光物质，或者本身不发出荧光但经衍生后可以发出荧光物质。在对目标物质的检测中，检测器的灵敏度十分重要，荧光检测器的灵敏度通常高于紫外检测器。因此，在呋喃丹检测中优先考虑使用荧光检测器。在200～700 nm波长范围内对呋喃丹进行激发光谱和发射光谱扫描，发现呋喃丹在270 nm处激发强度最大，在310 nm处发射强度最大。另外，通过对呋喃丹进行紫外光谱扫描，发现呋喃丹在210 nm附近有最大吸收，但其响应值仅为荧光检测器(激发波长270 nm，发射波长310 nm)响应值的1/5，并且在210 nm波长附近存在较强的基质干扰。

因此本研究选择用荧光检测器进行检测，选择 270 nm作为激发波长，310 nm作为发射波长。

2.2流动相的选择

对于反相色谱，最常用的流动相为乙腈-水和甲醇-水体系。本文考察了乙腈-水和甲醇-水体系下的呋喃丹的出峰情况，发现2种体系下呋喃丹峰形均良好。考虑到甲醇-水体系下液相系统压力较高，因此选择乙腈-水体系作为本研究的流动相。在流动相为乙腈-水(40∶60，V/V)、流速0.200 mL·min-1以及柱温40℃条件下，呋喃丹保留时间约为3.7 min，与样品基质分离完全，无干扰，保证了呋喃丹定性和定量的准确性。

2.3固相萃取柱的选择

各取200 mL空白水样，按照1.3的方法分别过HLB小柱和C18小柱，处理完成后上机检测，考察2种小柱的净化效果。结果表明，在呋喃丹出峰时间附近，2种小柱净化后的样品谱图基线平稳，均无基质干扰。

往200 mL空白水样中加入0.500 μg呋喃丹，此时水样中呋喃丹的浓度为2.50 μg·L-1，以5 mL·min-1流速上样，分别考察HLB小柱和C18小柱的加标回收率。结果发现，C18小柱的回收率在70%～85%之间，HLB小柱的回收率在88%～95%之间，HLB小柱的回收率明显高于C18小柱。综合样品净化效果和加标回收率，本文选择HLB小柱作为水样的富集和净化小柱。

2.4水样上样速度的选择

往200 mL空白水样中加入0.500 μg呋喃丹，水样过 HLB小柱，考察3种上样速度(3、5、10 mL·min-1)下呋喃丹的回收率情况，结果如图1所示。当上样速度分别为3 mL·min-1和5 mL·min-1时，回收率均可稳定保持在85%以上，两者无显著性差异。当上样速度为10 mL·min-1时，回收率约为67%，较上样速度为3 mL·min-1和5 mL·min-1时的回收率明显偏低。综合加标回收率和样品前处理效率，水样的上样速度设定为5 mL·min-1。

2.5线性范围、检出限和定量限

将配制的浓度为20、50、100、250、500、1 000 μg·L-1的呋喃丹标准溶液进样分析，以峰面积(Y)为纵坐标、呋喃丹质量浓度(X，μg·L-1)为横坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=1 270X+293，相关系数R2>0.999。由此可知，呋喃丹在20～1 000 μg·L-1范围内线性关系良好。呋喃丹标样色谱图如图2所示。

方法的检出限和定量限通常分别按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比所对应的样品浓度来确定。往空白水样中加入呋喃丹，当水样中的呋喃丹浓度为0.100 μg·L-1时，按照本方法进行样品处理和上机检测，6份加标样品在仪器上的响应值均能满足S/N≥3。当空白加标水样中的呋喃丹浓度为0.250 μg·L-1时， 6份加标样品在仪器上的响应值均能满足S/N≥10，回收率

在91.5%～103%之间，精密度为4.23%。由此确定方法的检出限为0.100 μg·L-1，定量限为0.250 μg·L-1。

GB/T 5750.9—2006《生活饮用水标准检验方法 农药指标》中呋喃丹的检出限为0.125 μg·L-1，本方法的检出限为0.100 μg·L-1，由此可以看出，两种方法的检出限较为接近。这表明本方法与柱后衍生荧光检测法灵敏度差别不大，但本方法省去了柱后衍生的繁琐操作，很大程度上提高了方法的简便性和稳定性。本方法检出限和定量限完全满足NY/T 5361—2016《无公害农产品 淡水养殖产地环境条件》的要求。

2.6方法回收率和精密度

往空白水样中添加不同量的呋喃丹，得到3个浓度梯度水平的加标样品，含量分别为0.250、2.50、10.0 μg·L-1，每个浓度水平6份样品。按照上述方法进行样品处理和检测，回收率和精密度结果如表2所示，呋喃丹的平均回收率在90.4%～96.3%之间，相对标准偏差在2.55%～5.10%之间。空白样品和加标样品的色谱图如图3和图4所示。

表2 加标样品的回收率和精密度

2.7实际样品分析

对采自福建省南平、三明和宁德地区的45份无公害水产品产地的淡水养殖水样和5份质控样品(包括1份空白水样和4份加标水样)，同时按照本方法进行样品处理和检测。其中，45份养殖水样均未检出呋喃丹；5份质控样品中，空白水样未检出呋喃丹，加标水样均有检出呋喃丹，回收率为88.5%～95.0%。质控结果满足分析要求，这说明实际样品的检测结果准确可靠。检测结果表明，上述无公害水产品产地的养殖水体的呋喃丹指标符合NY/T 5361—2016《无公害农产品 淡水养殖产地环境条件》的要求。

3 结论

本文采用全自动固相萃取技术对淡水养殖水体中的呋喃丹进行富集、净化和浓缩，然后用超高效液相色谱-荧光检测法进行测定。本方法样品前处理自动化程度高，测定时无需进行柱后衍生操作，方法简便、快速、准确，灵敏度高，稳定性好，适用于淡水养殖水体中呋喃丹的检测。

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Determinationofcarbofuraninfreshwateraquaculturewaterbyultrahighperformanceliquidchromatographywithautomaticsolidphaseextraction

NIUYuehua

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center， Fuzhou 350003， China)

A new method was developed for the determination of carbofuran in freshwater aquaculture water by ultra high pressure liquid chromatography (UPLC) combined with automatic solid phase extraction (SPE). The water sample flowed through HLB SPE cartridge with a flow rate of 5 mL·min-1， and the analyte was eluted with 10 mL methanol in SPE cartridge. After concentrating and redissolving with acetonitrile-water (40∶60，V/V)， the eluent was analyzed by ultra high performance liquid chromatography with fluorescence detection. The analysis conditions were as the follows： chromatographic column was ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm)， mobile phase was acetonitrile-water (40∶60，V/V)， flow rate was 0.200 mL·min-1， excitation wavelength was 270 nm， emission wavelength was 310 nm. The correlation coefficients of carbofuran standard curve was more than 0.999 in the range of 20 ～ 1 000 μg·L-1. The limit of detection was 0.100 μg·L-1and the limit of quantitation was 0.250 μg·L-1. The average recoveries were in the range of 90.4% ～ 96.3% and the relative standard deviations were 2.55% ～ 5.10% at 0.250 μg·L-1， 2.50 μg·L-1and 10.0 μg·L-1spiked levels. The method was highly automated， simple， rapid， accurate and stable， and also suitable for the determination of carbofuran in freshwater aquaculture water.

carbofuran; ultra high performance liquid chromatography; automatic solid phase extraction; freshwater aquaculture water

O657.7

A

1006-5601(2017)05-0386-06