苗雨润 宋庆凯 匡德宣 陈玲霞 尹博文 李晓飞 代解杰

基础研究

新生树鼩心肌细胞与心肌成纤维细胞的分离培养、纯化及鉴定

苗雨润 宋庆凯 匡德宣 陈玲霞 尹博文 李晓飞 代解杰

作者单位：650118 云南省昆明市，中国医学科学院/北京协和医学院，医学生物学研究所，云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，树鼩种子资源中心

目的 研究应用树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的纯度较高、活力较强的心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。方法 使用差速贴壁1.5 h纯化心肌细胞进行培养,并比较5-溴-2-脱氧尿苷、阿糖胞苷及TGF-β抑制剂的纯化效率以获取最适纯化方案，培养过程在37℃、5%CO2条件下进行。使用MTT法测定细胞活力以确定方法可行性。利用α-横纹肌肌钙蛋白（α-SA）及心肌肌钙蛋白I（TnI）对树鼩心肌细胞进行免疫组化及免疫荧光鉴定，利用波性蛋白（Vimentin）对树鼩心肌成纤维细胞进行免疫荧光染色以达到鉴定目的。结果 原代培养新生树鼩心肌细胞生长良好。在倒置显微镜下观察，培养10 d左右的心肌细胞可以基本完成局部融合并伴有细胞搏动。MTT法检测结果显示，心肌细胞活力可以在最少15 d内保持良好水平。细胞鉴定结果显示，树鼩心肌细胞α-SA免疫组化呈阳性，Tn I免疫荧光鉴定呈阳性，心肌成纤维细胞呈阴性，符合一般心肌细胞特征；心肌成纤维Vimentin免疫荧光结果呈阳性。结论 分离纯化得到的树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞纯度较高、结构完整并具有相对较高的细胞活力，是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞。

树鼩； 原代培养； 心肌细胞； 心肌成纤维细胞； 鉴定

心肌细胞的原代培养，是进行心血管疾病研究的一项基础工作，体外培养的心肌细胞保存了结构及功能上的某些特点，同时去除了体内各种神经、体液因素对心肌细胞的影响。目前，心肌细胞原代培养技术已被广泛应用于心血管疾病机理、阐明药物或毒物的心肌毒性作用机制，以及心脏组织工程学等研究[1]。自 Harary等[2]在 1960年首次成功对乳鼠心肌细胞进行体外培养，后又经Baudino等[3]不断的改进，心肌细胞的体外培养技术已经有了长足的进展。但是由于细胞体外培养在实验条件和技术等方面都存在一些不足，关于心肌细胞体外培养的方法国内外许多学者仍然在不断地进行探索和改进。常被用于心肌毒理、药理研究模型的动物是大鼠和小鼠。但这两者和人类的差异较大，往往不能更好地、更真实地反映一些药物的作用机制，这成为心血管毒理、药理研究的桎梏。近年来，树鼩作为一种新型实验动物广泛应用于各种疾病、药理模型。由于相对于大鼠、小鼠而言，树鼩在进化程度上更接近人类，加之与非人灵长类动物相比，树鼩来源广泛、价格低廉，可以推测树鼩在构建心血管疾病方面具有更好的前景。但截至目前依旧没有关于体外树鼩心肌细胞原代培养的报道。本研究对报道的大鼠、小鼠心肌细胞原代体外培养方法加以改进，培养出纯度较高、活力较强的新生树鼩心肌原代细胞,以填补树鼩在心血管疾病研究方面的空白，满足科学实验的需求。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验使用的实验动物是由中国医学科学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供的新生树鼩12只，雌雄不限，成年树鼩体重110~130 g，幼年树鼩体重不等。实验动物生产许可证：SCXK（滇）K2013-0001，使用许可证：SYXK（滇）K2013-0001。

1.2 主要试剂及仪器 DMEM/Highglucose细胞培养液（GE），胎牛血清（FBS，BI），0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 混合消化液（BI），胶原酶（Solarbio），中性蛋白酶（Solarbio），二硫苏糖醇（DTT），抗坏血酸钠（Solarbio），ITS（Insulin-Transferrin-Selenium Solution，Gibco），5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU，Sigma），阿糖胞苷（索莱宝），选择性ALK5抑制剂（SB431542，Selleck），α-横纹肌肌动蛋白（α-SA）小鼠抗人一抗（Santa Cruz，sc-58670），心肌肌钙蛋白 I（TnI）兔多克隆抗体（abcam，ab47003），波性蛋白（Vimentin）小鼠多克隆抗体（Merck，CBL202），FITC标记羊抗兔IgG 二抗（Merck），HRP 标记的兔抗鼠 IgG（Merck），青霉素，链霉素，显微操作仪，倒置显微镜，CO2孵育箱。

1.3 试验方法

1.3.2 原代细胞培养 在DMEM/Highglucose培养液内添加 20%FBS、5 μg/ml抗坏血酸钠溶液、1%ITS（Insulin transferrin selenium）、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素，在37℃、5%CO2条件下培养，隔日换液。

1.3.3 树鼩心肌细胞的纯化 使用梯度贴壁法去除心肌成纤维细胞。将原代细胞消化后重悬至25 cm2细胞培养瓶中，1.5 h后将细胞悬液吸至另一个25 cm2细胞培养瓶中，4 h后将未贴壁细胞悬液移至另一个25 cm2细胞培养瓶中。重复3次做3组平行实验组，并分别在培养液内添加5-溴-2脱氧尿苷（0.1 mM），TGF-β 抑制剂（SB431542，10 μM），阿糖胞苷（2 mg/L）加入其中抑制心肌成纤维细胞生长。

1.3.4 MTT法测定心肌细胞增殖活力 取生长良好的心肌细胞，以每孔约2×103个细胞等量接种于96孔板中，每孔加入100 μl培养液，置于37℃、5%CO2细胞培养箱内孵育。每隔24 h向其中5孔加入5 g/L的MTT溶液 20 μl，孵育4 h后弃掉培养液，加入 150 μl的 DMSO，置于 37 ℃、5%CO2孵育10 min，每日测3孔，连续测7 d。设立平行对照孔（仅加入培养液）并调零，用酶标仪在 490 nm波长处测定各孔的光密度值（OD 490 nm），MTT法连续7 d测定心肌细胞增殖及存活能力。

1.3.5 树鼩心肌细胞的鉴定

1.3.5.1 心肌细胞α-SA和TnI抗原鉴定 使用免疫组化的方法鉴定α-SA抗原。取融合至80%以上的心肌细胞，PBS清洗2次，每次3 min；4%甲醇溶液固定10 min，PBS清洗3次，每次 2 min；0.5%Txiton X-100处理20 min，PBS漂洗3次；3%H2O2溶液室温处理10 min，灭活内源性酶。PBS清洗3次，滴加5%BSA封闭液室温下20 min，滴加 α-SA单克隆抗体一抗（1∶200），4℃冰箱过夜孵育。PBS清洗3次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记抗鼠IgG，37℃湿盒中孵育20 min。PBS清洗4次，DAB显色，苏木素轻度复染1 min，室温吹干封片。心肌成纤维细胞按上述方法进行免疫细胞化学染色，作为阴性对照。

使用免疫荧光的方法鉴定TnI抗原。取融合至80%以上的心肌细胞，PBS清洗2次；使用4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次（每次2 min）；0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次；山羊血清封闭液封闭30 min，PBS漂洗3次；加入1%BSA稀释的心肌肌钙蛋白I（TnI）兔多克隆抗体一抗（1∶1000），4 ℃过夜，PBS漂洗 3次；加入 1%BSA稀释的荧光标记羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。对成纤维细胞用相同方法进行免疫荧光染色，作为阴性对照。

1.3.5.2 心肌成纤维细胞Vimentin抗原的鉴定 使用免疫荧光的方法鉴定Vimentin抗原。取融合至80%以上心肌成纤维细胞，PBS清洗2次；使用4%的甲醛溶液固定20 min，PBS清洗3次（每次2 min）；0.5%的Triton-X100穿孔15 min，PBS漂洗3次，山羊血清封闭液封闭30 min，PBS漂洗3次；加入1%BSA稀释的波性蛋白（Vimentin）鼠多克隆抗体一抗（1∶1000），4 ℃过夜，PBS漂洗 3次；加入 1%BSA 稀释的荧光标记的兔抗鼠IgG（1∶200），37℃孵育1 h，PBS漂洗3次；抗淬灭封片剂封片，在荧光显微镜下观察。对心肌细胞用相同方法进行免疫荧光染色，作为阴性对照。

BIM技术具有三维可视化的特点，是对建筑及构件的直观表达。所见即所得的方式提高了理解和沟通的效率，降低了二维图纸阅读的专业性要求，对于复杂的空间关系，如复杂管线、体型复杂建筑等来说优势明显，如图2所示。

2 结果

2.1 树鼩心肌细胞形态学观察结果 刚分离的心肌混合细胞呈大小不一的球形，培养60 min细胞开始陆续贴壁生长。最先贴壁的为心肌成纤维细胞，细胞呈不规则形或椭圆形，后变为长梭形，培养2~3 d观察，可见明显增殖，7 d即可呈融合状态，细胞排列紧密，有的交叉重叠生长，无自发性搏动，传至P3代之后会出现明显衰老症状，细胞形态变大，增值速度大幅下降（图1D）；将90 min后未贴壁的心肌细胞悬液接种于25 cm2细胞培养瓶中，待心肌细胞贴壁后3 d，换普通培养基替代化学抑制培养基，继续培养3~5 d，观察到心肌细胞增殖缓慢，视野中绝大多数细胞为已开始自发性搏动的心肌细胞。换非化学选择性培养液5 d，开始呈现有规律、不同步搏动，7 d后细胞融合形成细胞簇或团，细胞呈现同步搏动，由周缘向心搏动，收缩明显而有力。见图1。

2.2 树鼩心肌细胞纯化比对结果 在更换普通培养基后7 d比对纯化结果，发现TGF-β抑制剂不但对成纤维细胞有影响，对心肌细胞的生长同样有影响。阿糖胞苷的纯化效率不高，在后续的鉴定中发现使用阿糖胞苷纯化的心肌细胞中混杂有大量的心肌成纤维细胞。相对来说，采用梯度贴壁法配合0.1 mM的BrdU在纯化心肌细胞过程中具有良好效果，并且对于心肌细胞的损伤较小。

2.3 树鼩心肌细胞活力检测结果 取采用5-溴-2-脱氧尿苷纯化过的心肌细胞进行检测。与心肌细胞生长前5 d比较，细胞活力差别有统计学意义（P＜0.01），提示增殖能力较弱；7~11 d变化较为显著，提示此段时间内细胞增殖相对旺盛，两两比较差别无统计学意义（P＞0.05）。结果说明心肌细胞增殖符合一般细胞增殖规律，本实验采用的消化法与纯化方案对树鼩心肌细胞的增殖没有显著影响。见表1。

表 1 BrdU纯化后的心肌细胞活力测定（n=3，±s）

注：与生长前 5 d 比较，aP＜0.01

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2.4 树鼩心肌细胞鉴定结果 树鼩心肌细胞α-横纹肌肌动蛋白（α-SA）免疫组化染色结果呈阳性，细胞质被染成褐色，符合树鼩心肌细胞的一般特征；对照组心肌成纤维细胞呈阴性结果。见图2。

树鼩心肌细胞TnI免疫荧光染色呈阳性，对照组心肌成纤维细胞有极个别细胞被染色，说明杂有部分心肌细胞，见图 3。

树鼩心肌成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色结果呈阳性，对照组心肌细胞染色结果呈阴性结果。见图 4。

3 讨论

自20世纪50年代细胞的体外培养技术兴起以来，心肌细胞的体外培养在国内外已有不少报道，且培养技术一直不断改进[2-5]。目前，心肌细胞原代培养技术已被广泛应用于心血管疾病机理、阐明药物或毒物的心肌毒性作用机制，以及心脏组织工程学等研究[6]。近年来，树鼩作为一种新型的实验动物被广泛应用于各种人类疾病模型的建立。有人认为，树鼩作为低等灵长类动物，有望替代啮齿类动物更好地模拟人的血液病及心脑血管病的发生和病理进程，以及药物药效和毒理反应等[7]，其中不乏一些成功的模型建立例子，包括Li等[8]利用细菌脂多糖（LPS）建立的树鼩败血症模型，树鼩对LPS的反应跟小鼠有较大差异，而与人更为接近；Li等[9]用树鼩开展脑缺血疾病研究，已成功建立了光诱导树鼩脑缺血模型。由于树鼩颅骨很薄，可通过光照射进行诱导，使大脑血管形成血栓，造成大脑缺血；加上其大脑发达，与灵长类接近，且经济、容易饲养，被认为是研究脑血管疾病机制的理想动物。这提示我们，利用树鼩建立各种心血管疾病病理、药理模型相对于啮齿类已有的模型可能会更具有研究价值，更贴近人类的病理、药理反应。但此前并没有关于树鼩心肌细胞体外培养的报道，而且以往心肌细胞的培养技术存在方法复杂、细胞活力难以维持[10]、杂质成纤维细胞难以被纯化等问题[11]，因此，寻求一种有效、简单、经济、实用的适用于树鼩心肌培养方法，对心血管疾病机理、阐明药物或毒物的心肌毒性作用机制，以及心脏组织工程学等研究可能提供重要帮助。

心脏是由心肌细胞和非心肌细胞组成，其中心肌细胞约占心脏组织的25%，近75%的细胞是非心肌细胞（如成纤维细胞和血红细胞），心肌成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁且具有分裂很强的增殖能力，很容易生长成优势细胞[12]。心脏成纤维细胞构成心肌层绝大多数的非心肌细胞，对心肌功能的正常运作起着重要作用。在已报道的心肌细胞原代培养中，分离心肌细胞的方法主要有机械收集法[13]和酶消化法[14]。机械收集法即用吸管反复吹打达到分离目的以获得心肌细胞，但这种方法的局限性在于吹打的强度难以控制，极易对心肌细胞造成损伤；酶消化法主要通过单一的胰蛋白酶或胶原酶或两者混合的方法对细胞间连接进行消化，以达到分离的目的，但单一高浓度的酶极易损伤细胞膜及胞内的微丝、微管，对获得的心肌细胞造成巨大的损伤。本实验使用的混合酶主要行使分离作用的是Ⅱ型胶原酶与中性蛋白酶，并将两者浓度降低到最低限度，在达到分离目的的同时最大程度上保护细胞免受损伤。

心肌成纤维细胞的清除一直是心肌细胞体外培养所面临的一个问题。梯度贴壁法是最常用的一种纯化方法[15]，其最大的优势在于成本低廉，对细胞无损伤，但这种方法往往纯化效率并不高。姜雪松[16]使用了2 mg/L的阿糖胞苷用于SD小鼠心肌成纤维细胞的纯化，但实验中发现，这种纯化方法在体外培养树鼩心肌细胞的过程中纯化效率有限。此前我们在培养角膜细胞的过程中发现，TGF-β抑制剂（SB431542）可以有效抑制杂质成纤维细胞的生长和增殖，但在心肌细胞的培养中发现这种抑制剂对树鼩的心肌细胞同样具有很大损伤。本实验首次横向比较三种纯化方案，并进行比较，最后采用了梯度贴壁法联合0.1 mM的5-溴脱氧尿苷方法达到了纯化目的，而且对树鼩心肌细胞没有明显的损伤。

心肌组织是一种横纹肌。肌动蛋白是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。肌动蛋白具有收缩功能，分布广泛，在细胞分泌、吞噬、移动、细胞质环流和细胞质分裂等生命活动中起重要作用。α-横纹肌肌动蛋白（α-SA）的免疫鉴定被广泛认为可以作为心肌细胞的鉴定标准[17]。心肌肌钙蛋白（Tn）是组成横纹肌细丝的结构蛋白，可调节钙介导的肌动蛋白和肌球蛋白之间的相互反应，本身为多肽，其亚单位I、T和C组成复合物。其中TnI是肌原纤维ATP酶的抑制单位，可抑制肌球蛋白与肌动蛋白结合，阻止肌肉收缩[18]。心肌肌钙蛋白作为心肌肌肉收缩的调节蛋白，可以作为心肌细胞特异性鉴定的一个指标。故本实验用α-SA和TnI单克隆抗体来进行免疫组化及免疫荧光标记的方法来鉴定心肌细胞，心肌细胞呈阳性反应结果，在α-SA和TnI的双重鉴定标准之下，基本可以确定我们体外培养的细胞为心肌细胞。

实验中发现，细胞体外培养过程中并非一贴壁即可产生搏动现象，推测可能是细胞体外培养初期适应新环境的一个过程。此外，心肌细胞相对于心肌成纤维细胞来说，增殖能力较差，后续实验中会逐步优化培养基来应对这种情况，但推测这也可能是由于心肌细胞是一种高度分化细胞，所以其增值能力较差。

本研究通过长时间实验及多种方法的比较证实，利用胶原酶Ⅱ与中性蛋白酶联合消化心脏组织，通过3次差速贴壁联合5-溴脱氧尿苷的使用，能较好地分离纯化树鼩心肌细胞和心肌成纤维细胞，可以保证细胞纯度较高、细胞结构完整及相对较高的细胞活力，是一种较为理想的、可以应用于树鼩建立人类心血管病理、毒理细胞模型的心肌细胞和心肌成纤维细胞，为日后可能应用树鼩作为心血管疾病病理模型建立良好基础。

图1 树鼩心肌细胞系形态学观察结果（100×）

图2 树鼩心肌细胞α-SA免疫组化染色结果（100×）

图3 树鼩心肌细胞TnI免疫荧光染色结果（100×）

图4 树鼩心肌成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色结果（100×）

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编者·作者·读者

《传承国医精华践行人文精神》——中国医学人文大会倡议书（二）

因此，我们向全国医务工作者提出如下倡议：

作为新中国新时代的白衣天使，我们应对让中华医学之美德与智慧贯穿于育人求学之全方位、贯穿于医患诊疗之全过程。在中医药现代化、国际化的今天，我们应当更加深入挖掘国医精华，锤炼人文品格。把跨越时空、超越国度、富有永恒魅力、具有当代价值的文化宝藏弘扬起来！

朋友们！同道们！让我们重温唐代大医“药王”孙思邈《大医精诚》中的铮铮誓言，从中汲取能量，砥砺前进：

“凡大医治病，必当安神定志，无欲无求，先发大慈侧隐之心，誓愿普救含灵之苦。若有疾厄来求救者，不得问其责贱贫富，长幼妍媸，怨亲善友，华夷智愚，普同一等，皆如至亲之想；亦不得瞻前顾后，自虑吉凶，护惜身命。见彼苦恼，若己有之，深心凄怆，勿避艰险、昼夜、寒暑、饥渴、疲劳，一心赴救，无作功夫形迹之心，如此可为苍生大医：反此则是含灵巨贼。”

让我们共同携手，为中国梦、中医梦、健康中国梦的实现而努力奋斗！

（中国医师协会 供稿）

Isolation，primary culture and purification of neonatal tree shrew cardiac fibroblasts and cardiac myocytes

MIAO Yu-Run，SONG Qing-Kai，KUANG De-xuan，et al.Center of Tree Shrew Germplasm Resources，Institute of Medical Biology，the Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China

ObjectiveTo explore the effective culture conditions and methods of primaryneonatal tree shrew cardiomyocytes，to culture cardiac cells with high purity，and long survival time.MethodsCulturing the cardiomyocytes after purified by the method of different speed adherence for 1.5 hour at 37 ℃ under 5%CO2conditions，then comparing the purification efficiency of bromo-2-deoxy-uridine，cytarabine and TGF-β inhibitor to obtain optimum purification protocol.Cell viability was measured using the MTT assay to determine the feasibility of the method.Immunofluorescence used α-SA and TnI antibody in order to achieve the purpose of identification for cardiomyocytes.Immunofluorescence used Vimentin antibody in order to achieve the purpose of identification for cardiac fibroblasts.ResultsNeonatal tree shrew cardiomyocytes in primary cultured grow well.When observed under inverted microscope，the cells which cultured for 10 days showd connection and began tobeat spontaneously.The MTT assay results showed that the detection of myocardial viability can maintain a good level in 15 d at least.Tree shrew Cardiomyocytes by immunofluorescence staining of α-SA and TnI monoclonal antibodies showed positive.Tree shrew Cardiac fibroblasts by immunofluorescence staining of Vimentin monoclonal antibodies showed positive.ConclusionCardiomyocyteswhich can survive for a long time with high purity can be obtained by this method，is a stable and reliable method of primary cultured tree shrews cardiomyocytes.

Tupaia belangeri； Primary culture； Cardiomyocytes； Cardiac fibroblasts； Authenticate

DAI Jie-jie，E-mail：djj@imbcams.com.cn

国家科技支撑计划项目（项目编号：2014BAI01B00）；云南省联合支持国家计划项目（项目编号：2015GA009）

代解杰，E-mail：djj@imbcams.com.cn

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.10.021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）10-0950-05

2017-02-27）