偶氮胂Ⅲ分光光度法测定药物中的格拉司琼
2017-10-15周清清
周清清， 彭 建， 江 虹
(长江师范学院化学化工学院，重庆 408100)
盐酸格拉司琼属抗肿瘤类辅助药，主要用于治疗因放射治疗及细胞毒类药物化疗引起的恶心和呕吐，在临床上广泛应用，是临床上的首选药物。目前测定格拉司琼的方法主要是高效液相色谱法[1 - 5]，也有电化学法[6]和液相色谱-质谱联用法[7 - 8]等报道。高效液相色谱法前处理较麻烦、费时，不能满足急检的需要。本工作采用仪器价廉，操作简单、并有较高灵敏度的分光光度法研究格拉司琼的测定方法，迄今未见文献报道。实验发现，在弱碱性条件下，酸性双偶氮染料偶氮胂Ⅲ能与格拉司琼发生显色反应生成离子缔合物，新物质的吸光度与一定浓度范围的格拉司琼的浓度呈线性关系，服从朗伯-比尔定律。方法用于盐酸格拉司琼药物及人体血液中格拉司琼的测定，回收率为99.2%～102%，相对标准偏差为1.8%～2.3%。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
U-4100型紫外-可见-近红外分光光度计(日本，日立公司)；pHS-3C精密酸度计(上海虹益仪器仪表有限公司)。
偶氮胂Ⅲ(AZO Ⅲ，麦卡希试剂有限公司)溶液：1.0×10-3mol/L。格拉司琼(GRS，重庆药检所提供)标准溶液：312.4 mg/L，冰箱4 ℃保存，操作液为31.24 mg/L。pH=3.0～9.5的Tris-HCl缓冲溶液：0.10 mol/L的HCl和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度计测定。所有试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸镏水。
1.2 实验方法
于10 mL具塞比色管中，准确加入适量的31.24 mg/L格拉司琼标准溶液或样液，0.50 mL pH=7.76的Tris-HCl缓冲溶液和1.5 mL 1.0×10-3mol/L偶氮胂Ⅲ溶液，用水稀至10 mL，摇匀，10 min后，用1 cm 比色皿，以试剂空白为参比，于648 nm或602 nm处测定溶液的吸光度A。
2 结果与讨论
2.1 光谱特征
图1 吸收光谱Fig.1 The absorption spectra 1.3.12 mg/L GRS;2.1.5×10-4 mol/L AZO Ⅲ;1-2.against water;3-9.(0.625,1.25,1.87,2.50,3.12,3.75,4.37 mg/L)GRS-1.5×10-4 mol/L AZO Ⅲ,against reagent blank;pH=7.76.
从图1可知，在400～700 nm范围内，格拉司琼几乎无吸收，偶氮胂Ⅲ有较强吸收，最大吸收波长位于556 nm。当在弱碱性的格拉司琼溶液中加入偶氮胂Ⅲ溶液后，吸收曲线上出现两个较大的吸收峰，最大吸收波长位于648 nm，红移92 nm，次大吸收波长位于602 nm，红移46 nm，表明格拉司琼与偶氮胂Ⅲ反应确实生成了新物质。新物质在648 nm和602 nm波长处，其吸光度与一定浓度范围内的格拉司琼的质量浓度呈正比，服从朗伯-比尔定律，故可用于格拉司琼的定量分析。
反应机理：偶氮胂Ⅲ是酸性双偶氮染料，磺酸根上的氢可离解，使自身带负电荷，故可与质子化的格拉司琼以静电引力结合生成离子缔合物。
2.2 反应条件的选择
2.2.1溶液酸度室温下，试验了不同pH的Tris-HCl缓冲溶液对体系灵敏度的影响。结果表明：在弱碱性溶液中，体系有较大灵敏度。实验用pH=7.76的Tris-HCl溶液，用量以0.5 mL 为宜。
2.2.2显色剂的浓度室温下，试验了不同浓度的偶氮胂Ⅲ溶液对体系灵敏度的影响。结果表明：偶氮胂Ⅲ溶液浓度为1.5×10-4mol/L时，体系有较大灵敏度。实验用1.0×10-3mol/L偶氮胂Ⅲ溶液，用量为1.5 mL。
2.2.3试剂加入顺序室温下，试验了偶氮胂Ⅲ、格拉司琼及Tris-HCl溶液在不同加入顺序时对体系灵敏度的影响。结果表明：按任意顺序加入试剂，基本不改变体系的灵敏度。故实验时可以任意顺序加入试剂。
2.2.4反应时间室温下，试验了不同反应时间对体系灵敏度的影响。结果表明：偶氮胂Ⅲ与格拉司琼的反应在10 min内即可完成，其稳定时间至少1 h。实验选在10 min后测定。
2.3 标准曲线
在最佳条件下配制标准系列溶液并按实验方法扫描吸收光谱，作A-c工作曲线。该方法的一元线性回归方程、相关系数、线性范围及表观摩尔吸光系数等列于表1。
表1 标准曲线相关参数
2.4 共存物质的影响
2.5 样品的测定
取成都恒瑞制药有限公司盐酸格拉司琼片10粒于小烧杯中，用水溶解并过滤，滤液转入1 000 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，得待测液1#。取成都普什制药有限公司盐酸格拉司琼注射液1支，内容物置于500 mL容量瓶中，用水稀至刻度，摇匀，得待测液2#。取重庆涪陵中心医院提供的新鲜人体血样适量，以4 000 r/min离心分离20 min，取上清液1.0 mL于离心管中，加入2.0 mL甲醇，摇匀，溶液离心分离10 min，将离心液用水定容至25.0 mL，得待测液3#。
取上述各待测液2.0 mL，分别按实验方法配制溶液并在602 nm处测定，各平行测定6份，同时作加标回收试验(n=6)，结果见表2。
表2 样品分析结果及回收试验(n=6)
ND:not detected.
3 结论
在弱碱性条件下，用偶氮胂Ⅲ分光光度法可测定格拉司琼的含量，方法简便、快速、有较高的的灵敏度和选择性，可用于盐酸格拉司琼片剂、注射液及人血中格拉司琼的准确测定。
