杨红艳， 于永丽*， 王月红， 王 猛

(1.东北大学理学院，辽宁沈阳 110819；2.中国刑警学院痕迹检验技术系，辽宁沈阳 110035)

稀土离子因其特殊的4f电子组态能级及跃迁模式而呈现出独特的光学性能，如Stokes位移大、发射谱带窄、发光寿命长、发光稳定性好等[1]。依据发光机理，稀土发光材料可分为上转换发光和下转换发光。上转换发光材料作为荧光探针，通常采用近红外光激发，由于近红外光对生物组织具有较强的穿透能力，因此，上转换发光材料在细胞以及生物组织成像的研究中具有特别的优势[2 - 3]。与上转换材料相比，下转换材料的优点是合成方法简单，易于实现粒子的功能化修饰，产物的发光强度大[4]。目前，下转换纳米粒子的应用主要集中在靶向给药[5]、发光共振能量转移[6]和免疫分析[7 - 8]等方面。作为稀土发光材料的基质材料，磷酸盐具有稳定性好、不易分解、生物毒性低等优点，而以LaPO4为基质，Ce、Tb共掺的纳米材料发光强度大，光学性能优异[9]。

细胞色素C(Cyt C)是一种以铁卟啉为辅基的可溶性色素蛋白，普遍存在于原核生物及真核生物的需氧组织中，在生物氧化过程中是一种非常重要的电子传递体，具有激活细胞呼吸能力的作用，临床上将其作为组织缺氧治疗的急救用药和辅助用药。有研究表明，Cyt C与细胞凋亡有关，从线粒体中泄露出的Cyt C有诱导细胞凋亡的作用[10]。2014年以来，已报道测定Cyt C的方法主要有电化学法[11]、表面等离子共振法[12]、荧光法[13 - 14]和共振瑞利散射法[15]。这些测定方法各有特点，如较高的灵敏度和较宽的线性范围，但也存在电极和荧光探针的制备比较复杂耗时[11 - 14]的缺点。

本文采用水热法制备了膦酰基羧酸共聚物(POCA)修饰的LaPO4∶Ce,Tb 纳米粒子(LaPO4∶Ce,Tb NPs)，该合成方法反应条件温和、简单快速，制备的纳米粒子发光强度大、水溶性好，无需后续功能化修饰。在适当的pH值下，LaPO4∶Ce,Tb NPs和纳米金(Au NPs)可通过静电作用与Cyt C结合，据此构建了以Cyt C为桥，LaPO4∶Ce,Tb NPs为能量供体，Au NPs为能量受体的发光共振能量转移(LRET)体系，建立了一种测定 Cyt C的新方法。目前，尚未见有以稀土下转换纳米粒子为发光探针测定Cyt C的报道，本文的研究内容拓展了稀土探针在生物分析领域中的应用。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

傅立叶红外光谱采用美国Perkin-Elmer公司Spectrum one傅立叶红外光谱仪(KBr压片，扫描范围为400～4 000 cm-1)；X-射线衍射(XRD)表征采用荷兰PANalytical公司Rigaku/Dmax-r B X-射线衍射仪(Cu靶Kα辐射，扫描范围为10°～60°)；透射电镜(TEM)形貌分析采用美国FEI公司Tecnai G20透射电子显微镜；发光光谱采用美国瓦里安公司Cary Eclipse荧光分光光度计扫描纳米粒子溶液的激发和发射光谱(狭缝宽度为10.0 nm，电压550 V，扫描速度为240 nm/min)。

La2O3、Tb2O3均为高纯试剂(中国医药集团上海试剂公司)；Ce(NO3)3·6H2O、HAuCl4·3H2O均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；膦酰基羧酸共聚物(POCA)(山东泰和水处理有限公司，固含量31.49%)；马心细胞色素C(含量≥95.0%,Sigma公司)。实验用水为三次蒸馏水。

1.2 实验过程

1.2.1LaPO4∶Ce,TbNPs和AuNPs的制备分别移取2.5、1.5和1.0 mL浓度为 0.1 mol·L-1的La(NO3)3、Ce(NO3)3和Tb(NO3)3溶液于锥形瓶中，然后滴加26 mL 1∶100(POCA和水的体积比)的POCA溶液和4.0 mL浓度为0.1 mol·L-1的Na3PO4溶液，用NaOH溶液调节上述溶液pH值为9.0，然后将其密封于聚四氟乙烯衬底的高压反应釜中，在160 ℃恒温下反应2 h。反应结束后冷却至室温，向产物溶液中加入两倍体积的甲醇，离心分离得到纳米粒子。之后用pH值为7.5的NaOH溶液分散，得到浓度为1.0×10-2mol·L-1LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液，待用。参照文献方法[16]制备Au NPs：首先在1.0 mL 1%HAuCl4溶液中加入80 mL水，磁力搅拌下加热至60 ℃，形成A液；再在2.0 mL 1%的柠檬酸钠溶液中加入20 mL水，同样加热至60 ℃，形成B液。10 min后将B液迅速倒入A液中，在磁力搅拌下反应30 min 后冷却至室温，得到浓度为2.5×10-4mol·L-1的Au NPs溶液。

1.2.2标准曲线的制作分别向一系列离心管中加入适量pH为7.0的浓度为0.15 mol·L-1硼酸-硼砂缓冲溶液(BBS)和300 μL 浓度为2.5×10-4mol·L-1的Au NPs溶液，然后依次加入不同体积(10.0～630 μL)浓度为100 μg·mL-1的Cyt C标准溶液，充分摇匀后加入200 μL浓度为1.0×10-2mol·L-1的LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液，最后用BBS定容至3.00 mL。将该溶液于35 ℃恒温振荡器中振荡反应40 min，用荧光分光光度计测定其在545 nm处的发光强度I，同时测定未加Cyt C时溶液的发光强度I0，以发光猝灭程度△I(△I=I0-I)对Cyt C浓度绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 LaPO4∶Ce,Tb发光纳米粒子的表征

图1 LaPO4∶Ce,Tb NPs的激发(a)和发射(b)光谱Fig.1 Excitation(a)and emission (b) spectra of LaPO4∶Ce,Tb NPs c=1.0×10-2 mol·L-1.

图1为所制备的LaPO4∶Ce,Tb NPs的激发(a)和发射光谱(b)。从图中可看出，纳米粒子在279 nm波长处有较宽的激发峰，这是Ce(Ⅲ)电子从4f向5d能级跃迁产生；以279 nm光激发时，纳米粒子分别在488、545、585和619 nm处有四个较强的发射峰，为Tb(Ⅲ)的特征发射，分别归属于Tb(Ⅲ)的7F6、7F5、7F4、7F3到5D4电子组态的跃迁[9]。由于LaPO4∶Ce,Tb NPs最大发射峰在545 nm处，所以，在紫外光激发下，LaPO4∶Ce,Tb NPs溶液呈现明亮的绿色。

图2 LaPO4∶Ce,Tb NPs的X-射线衍射(XRD)图(A)、透射电镜(TEM)图(B)和红外(IR)光谱图(C)Fig.2 XRD pattern(A), TEM image(B) and IR spectrum(C) of LaPO4∶Ce,Tb NPs

本实验制备了POCA修饰的LaPO4∶Ce,Tb NPs，由于POCA分子中有亲水性的羧基，所以纳米粒子的水溶性良好，且无需进一步修饰即可通过静电或共价作用与生物分子连接，实现分析应用。

2.2 发光共振能量转移体系的构建及机理探讨

图3 LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1)发射光谱(a)和Au NPs(c=2.5×10-4 mol·L-1)吸收光谱(b)Fig.3 Emission spectrum of LaPO4∶Ce,Tb NPs(a)(c=7×10-4 mol·L-1)and absorption spectrum of Au NPs(b)(c=2.5×10-4 mol·L-1)

发光共振能量转移(LRET)体系的建立需要满足三个条件[18]：(1)能量供体的发射光谱与受体的吸收光谱必须有足够的重叠；(2)能量供体和受体的发射光谱有足够的分离，从而可以同时分别检测供受体的发射光谱；(3)能量供体和受体之间的距离必须足够接近。图3是LaPO4∶Ce,Tb NPs的发射光谱(a)与Au NPs的吸收光谱(b)。可看出，LaPO4∶Ce,Tb NPs的发射光谱和Au NPs的吸收光谱有很好的重叠，这满足了LRET的第一个条件。其次，Au属于猝灭性能量受体，在获得能量后不产生光发射，因此不会干扰供体发光强度的测定，这满足了第二个条件。最后，本实验制备的LaPO4∶Ce,Tb NPs表面修饰了POCA，由于POCA分子中的羧基在中性或碱性溶液中失去质子，所以粒子带有负电荷；Au NPs是通过柠檬酸钠还原法制备，其表面也带有负电荷[16]。LaPO4∶Ce,Tb NPs和Au NPs由于静电排斥作用，二者不能建立共振能量转移体系。当向上述体系中加入Cyt C时，在本实验条件下(pH=7.0)，Cyt C带正电(等电点为10.8)，通过静电吸引作用，Cyt C可以和LaPO4∶Ce,Tb NPs以及Au NPs结合，形成以Cyt C为桥的LaPO4∶Ce,Tb-Cyt C-Au复合结构。此时，LaPO4∶Ce,Tb NPs和Au NPs的距离被缩短，满足了发光共振能量转移第三个条件，从而发生从LaPO4∶Ce,Tb NPs到Au NPs的能量传递，建立发光共振能量转移体系。图4为该共振能量转移体系的示意图。

图4 LaPO4∶Ce,Tb-Cyt C-Au发光共振能量转移示意图Fig.4 Schematic illustration of the LRET process from LaPO4∶Ce,Tb NPs to Au NPs

图5 不同浓度的 Cyt C对LaPO4∶Ce,Tb-Au体系发光强度的影响Fig.5 Effects of different concentrations of Cyt C on the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb-Au system 1-7：0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0 μg·mL-1.

向LaPO4∶Ce,Tb-Au体系中加入不同浓度Cyt C，测定溶液体系的发光谱图，结果见图5。由图5可以看出，体系发光强度随Cyt C浓度的增大而降低，这是因为，Cyt C的浓度越大，供体和受体结合的数目越多，LaPO4∶Ce,Tb NPs发光被猝灭的程度越严重。这为建立Cyt C的定量分析方法奠定了基础。

2.3 基于发光共振能量体系测定Cyt C

固定LaPO4∶Ce,Tb NPs的浓度为7.0×10-4mol·L-1，对测定Cyt C的实验条件进行了优化，Au NPs的加入量、反应溶液pH值和BBS浓度对纳米粒子发光猝灭的影响见图6。图6的纵坐标为纳米粒子发光被猝灭的百分率。由图6(A)可见，随着Au NPs加入量的增加，纳米粒子发光被猝灭的百分率逐渐增大，当Au NPs加入量大于300 μL时，发光被猝灭的百分率的增大幅度趋于平缓，选择Au NPs加入量为300 μL。由于本实验中Cyt C和LaPO4∶Ce,Tb NPs以及Au NPs是通过静电结合，为保证Cyt C带正电荷，必须控制溶液pH值在Cyt C的等电点(10.8)以下。同时为保证稀土粒子和纳米金带负电荷，pH值较大为好，因此实验选择考察的pH范围为6.0～10.0。由图6(B)可见，在pH为6.0～7.0时，猝灭最大且数值稳定，所以选择pH值为7.0。在确定溶液pH值为7.0的基础上，为保证反应溶液pH值的稳定，需适量加入缓冲溶液，常见的缓冲溶液，如磷酸氢二钠-柠檬酸、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，加入后溶液中粒子发生凝聚，而BBS加入后体系稳定，因此选择BBS为该体系的缓冲溶液。考察了不同浓度BBS对纳米粒子发光猝灭的百分率的影响，由图6(C)可知，当BBS的浓度为0.15 mol·L-1时猝灭百分率最大。

图6 Au NPs加入量(A)、pH值(B)和BBS浓度(C)对LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1)发光猝灭的影响Fig.6 Effects of the volumes of Au NPs(A),pH values (B)and the concentrations of BBS(B) on the luminescent quenching of LaPO4∶Ce,Tb NPs(c=7×10-4 mol·L-1) I0:the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb NPs before adding Cyt C;I1:the luminescent intensity of LaPO4∶Ce,Tb NPs after adding Cyt C(c=2.0 μg·mL-1).

2.4 方法的选择性

为了考察该分析方法的选择性，实验考察了一些常见离子对LaPO4∶Ce,Tb-Au体系发光强度的影响。测定结果表明，在Cyt C的浓度为6.67 μg·mL-1时，当体系中K+、Na+、Mg2+、Al3+、Cl-的浓度为400 μg·mL-1时，Ba2+、Ca2+的浓度为100 μg·mL-1时，Zn2+、Mn2+、Cd2+的浓度为30 μg·mL-1时，体系相对发光强度变化程度均小于5%，即上述离子对体系无干扰。当Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+的浓度为0.5 μg·mL-1时，体系相对发光强度变化程度大于6%，说明此时这四种离子对测定有干扰。

2.5 方法的分析性能

在最佳实验条件下，当Cyt C的浓度在0.333～21.0 μg·mL-1范围内时，LaPO4∶Ce,Tb-Au体系发光猝灭强度△I与Cyt C的浓度(c)有良好的线性关系，线性回归方程为:△I=19.1c+28.0(c：μg·mL-1)，相关系数R=0.9962，检出限(S/N=3)为0.2 μg·mL-1。对浓度为10.0 μg·mL-1的Cyt C溶液平行测定11次，相对标准偏差(RSD)为0.46%。

2.6 样品分析

采用本文建立的分析方法测定某制药公司生产的细胞色素C注射液中的Cyt C，同时进行回收率实验，结果见表1。结果表明，该注射液中Cyt C含量为10.8 μg·mL-1，加标回收率为100%～101%，表明本测试方法准确可靠。实验建立的Cyt C的分析方法简单快速，选择性较好，检测灵敏度和文献报道[13 - 14]相当，可用于实际样品的测定。

表1 细胞色素C注射液中Cyt C含量的测定及回收率实验结果(n=5)

3 结论

本文采用水热法制备了光学性能优异的LaPO4∶Ce,Tb NPs，该粒子具有良好的水溶性和生物相容性，采用XRD、TEM和FTIR光谱对合成粒子进行了表征。以LaPO4∶Ce,Tb NPs为能量供体，Au NPs为能量受体，通过Cyt C桥的作用，基于静电引力构建了LRET体系。基于以上LRET体系，建立了测定Cyt C 的分析方法，该方法的线性范围较宽，灵敏度较高，选择性较好。一直以来，稀土上转换纳米粒子的制备及其应用都是研究热点，而关于稀土下转换纳米粒子的研究较少。鉴于下转换纳米粒子的制备方法简单易行、光学性能优异，相信在以后的科学研究中会受到更多的关注。