猪圆环病毒病的诊断分析

2017-10-12赵海忠李良华宋忠旭彭先文梅书棋

养猪 2017年5期

关键词：圆环毒株猪场

赵海忠，李良华，宋忠旭，孙华，彭先文，梅书棋

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064）

猪圆环病毒病的诊断分析

赵海忠，李良华，宋忠旭，孙华，彭先文，梅书棋

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北武汉 430064）

为了建立猪圆环病毒病快速有效诊断方法和综合防控措施，研究通过临床剖检、实验室检测等方法对湖北某猪场一例疑似猪圆环病毒病进行了病原学诊断，确诊为PCV2感染。PCR扩增产物测序，遗传进化分析显示基因型为PCV2e。通过免疫接种、对症治疗、生物安全防范、饲养管理进行综合防控，可实现猪群的整体健康稳定。

猪圆环病毒2型；诊断分析；PCV2e；综合防控

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原，其临床特征为病猪体质下降、消瘦、皮肤苍白、黄疸、腹泻、呼吸困难、衰弱甚至死亡等。PCV2具有免疫抑制性，主要损害猪的免疫系统，在全国范围内广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失[1-3]。

2016年7月，湖北省某规模化猪场猪群发生疑似猪圆环病毒感染病例，保育猪群中先后有60多头陆续发病，死亡15头。针对性采取了综合防控措施，有效阻止了疾病的暴发与蔓延，为同行PCV2的防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取具有典型临床症状、濒临死亡大约克保育猪5头，采集脾脏、淋巴结组织样品，按猪号进行1#～5#编号，供实验室检测。

1.1.1 主要仪器离心机（德国eppendorf），PCR扩增仪（EDC-810型），凝胶成像系统（Bio-RAD），电泳仪（DYY-8C型）。

1.1.2 引物及试剂扩增PCV2的ORF2基因引物，上游引物为 5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，下游引物为 5′-CGCACCTTCGGATATACTGTC-3′[4]，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。TaKaRa Mini BEST Viral DNARNA Extraction Kit Ver.4.0、Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）试剂盒、DL 2 000 DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。Taq DNA polymerase（PCR聚合酶）、DNA快速回收试剂盒为上海生工生物工程产品。阳性对照样品由动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室保存。

1.2 检测方法

1.2.1 临床观察及病理剖检了解该规模猪场猪群主要发病死亡情况，观察临床症状并拍照记录。选取5头濒临死亡症状典型的患病保育猪进行解剖，并详细记录各个器官的病理变化。采集每头猪只脾、淋巴结组织样品，冷藏保存后送实验室检测。

1.2.2 病原学检测按DNA提取试剂盒操作规程提取基因组DNA，采用PCR方法扩增PCV2的ORF2基因，待反应结束后取产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察结果。

1.2.3 基因测序分析对PCV2的ORF2基因阳性条带明显的PCR扩增产物4#、5#样本，送武汉擎科生物技术有限公司测序。从GenBank数据库中搜集PCV2各基因型主要代表毒株的ORF2基因，绘制PCV2的ORF2基因系统进化树，比对本试验毒株序列与其他毒株的遗传进化关系。

2 结果与分析

2.1 临床症状及病理剖检结果

发病猪为7～10周龄保育猪，初期出现食欲不振、呼吸困难、体温40.5℃左右，不爱运动，生长不整齐，少数病例腹泻；后期病猪表现为渐进性消瘦、被毛蓬乱、皮肤苍白（图1），厌食、精神沉郁、常呈趴卧姿势（图2），部分病猪在后肢和会阴部皮肤可见有暗红色不规则的斑点丘疹，最后病猪出现全身多系统衰竭而死亡。解剖后主要病变：腹股沟淋巴结明显肿大（图3），肾呈暗红色、表面有大小不一的灰白色的病灶，脾脏肿大表面有出血性梗死灶，肺水肿暗红色、各叶红色肝变期（图4）。

图1 渐进性消瘦、被毛蓬乱、皮肤苍白

图2 厌食、精神沉郁、呈趴卧姿势

图3 腹股沟淋巴结明显肿大

图4 肺水肿暗红色、各叶红色肝变期

2.2 病原学检测结果

样品PCV2病原检测，扩增PCV2的ORF2基因产物结果见图5。结果显示，全部样品扩增到ORF2基因494 bp的片段，检出PCV2阳性比例为100%，确诊感染PCV2。

图5 PCV2 PCR扩增产物

2.3 PCV2的ORF2基因测序结果

取4#、5#阳性条带明显PCR扩增产物进行测序，分别得到序列92 HBWH.3-2016.7、93 HBWH.4-2016.7，PCV2的ORF2基因系统进化树分析结果见图6，样品中检测到的圆环病毒2型与圆环病毒2e基因型代表毒株在同一分支，同源性高，证明本场猪感染PCV2e。

图6 PCV2的ORF2基因系统进化树

3 讨论与小结

3.1 病因分析

了解猪场PCV2原免疫程序：基础公母猪群每4个月普免1头份，仔猪14日龄免疫1头份。猪场严格按照免疫程序免疫接种圆环灭活疫苗，但部分保育猪仍感染PCV2引起死亡，分析其原因有三：一是免疫程序不合理，仔猪14日龄时自身免疫系统还未完善，同时母源抗体干扰，抑制了免疫反应[5]；二是PCV2a疫苗免疫效果不理想，本场免疫PCV2a疫苗为全病毒疫苗，增殖滴度较低[6]，但本场以PCV2e基因型为主，尽管PCV2a疫苗株能够为PCV2e毒株提供有效的交叉保护，但PCV2a与PCV2e毒株之间的抗原性存在一定差异，免疫针对性不强；三是消毒防疫不完善，消毒药品太单一，消毒方法、程序不科学，消毒不彻底留有死角，未能阻止PCV2在猪场传播。新疆、广东、山西等地先后报道PCV2e毒株[7-9]，但湖北该毒株很少见报道。本研究确诊检测到PCV2e毒株，为湖北PCV2的分子流行病学、遗传变异及防控奠定了基础。

3.2 综合防控

3.2.1 免疫接种 PCV2e基因型山西SXJZ分离株与疫苗株LG株（黑龙江）全基因组核苷酸序列同源性较高，为96.7%[9]，选LG株疫苗进行PCV2免疫。PCV2母源抗体干扰仔猪免疫应答，当母源抗体效价达到3log10左右时，几乎不影响仔猪免疫应答[5]；仔猪免疫后35 d即可获得较高水平的抗体，加强免疫时可以诱导机体产生更高水平的抗体，能够有效抵御PCV2的感染。猪场加强PCV2母源抗体监测，制订科学免疫程序，仔猪首免21日龄1头份，间隔21 d加强免疫1头份。

3.2.2 对症治疗可选择黄芪多糖注射液（0.2 mL/kg）+头孢噻呋钠或氨苄西林钠（0.025～0.05 g/kg），混合肌注，2次/d，连用3～5 d；同时对机体严重脱水、极度虚弱的猪只，静脉注射氨基酸、葡萄糖等，以补充体能，并配合饮水电解质多维等，以补充体液和调节体内代谢平衡[10]。做好妊娠母猪药物保健工作，可在产前、产后7 d，每吨饲料分别添加80%支原净125 g+10%盐酸多西环素1 000 g+50%复方黄芪多糖250 g+电解质多维1 000 g。

3.2.3 生物安全措施猪场封闭式管理，严格控制外来和本场人员进出；搞好猪舍清洁卫生，发现可疑病猪及时隔离，粪尿和病死猪进行无害化处理；选择广谱消毒剂，如过硫酸氢钾复合物粉、癸甲溴铵、碘制剂，轮换使用，科学彻底消毒，切断病毒在猪场内的传播，降低猪场病毒载量。规范种猪引种，隔离观察1个月，健康猪方可进场[11]。

3.2.4 饲养管理实施全进全出的饲养方式，降低饲养密度[12]；加强猪群护理，提供优质饲料，猪舍温度适宜控制在23～25℃，减少环境应激；仔猪断奶时在原产床上多停留3～5 d，添加药物保健，尽量避免大小不一仔猪混群，转群时注射抗应激药物，例如肌注长效土霉素1 mL，以减轻应激反应和增强抵抗力。

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