孟继明，唐红娜，刘晓明，王朝阳,2，任学群,2,3

1. 河南大学淮河医院 普外科，河南 开封 475000； 2. 河南大学 循证医学中心，河南 开封 475000； 3. 河南大学淮河医院 转化医学中心，河南 开封 475000

γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号通路对肝癌细胞增殖的影响

孟继明1，唐红娜1，刘晓明1，王朝阳1,2，任学群1,2,3

1. 河南大学淮河医院 普外科，河南 开封 475000； 2. 河南大学 循证医学中心，河南 开封 475000； 3. 河南大学淮河医院 转化医学中心，河南 开封 475000

〔目的〕 探索γ分泌酶抑制剂 MW167阻断Notch信号通路对肝癌细胞增殖的影响。〔方法〕 通过Western blotting 和RT-PCR方法检测Notch受体各亚型的表达。用不同浓度(5、10、20μmol/L)MW167处理肝癌细胞，48h后用Western blotting法检测Notch各蛋白的表达，采用RT-PCR法检测Notch信号通路下游基因HES1 mRNA表达，MTT法测定细胞增殖。〔结果〕 HepG2细胞中可检测到Notch1～4 蛋白和mRNA的表达。不管是与培养基对照还是DMSO对照相比，不同浓度MW167对Notch1～4蛋白的表达没有显著影响。与相应浓度的对照组相比，MW167处理组HES1 mRNA表达下降(P<0.05)。随着MW167处理浓度升高，HES1 mRNA表达抑制率逐渐升高(P<0.05)。MTT法检测结果显示，MW167处理的细胞，其吸光度高于对照组(P<0.05)，且随着MW167浓度的升高，细胞增殖率相应升高。〔结论〕HepG2细胞中可检测到Notch1～4蛋白和mRNA的表达，MW167处理可降低HES1 mRNA表达，MW167处理可促进细胞的增殖。

γ分泌酶抑制剂；MW167；Notch信号通路；肝细胞肝癌

Abstract: 〔Objective〕To explore the influence of blocking Notch signaling pathway by γ-secretase inhibitor on proliferation of HepG2 cells. 〔Methods〕The expression of Notch 1～4 was determined with Western blotting and RT-PCR methods. HepG2 cells were treated by 5, 10 and 20μmol/LMW167. 48h after treatment, protein expression of Notch 1～4 was determined. HES1 mRNA expression was measured by RT-PCR technology. Cell proliferation was determined with MTT method.〔Results〕The genetic and protein expressions of Notch 1～4 were observed in HepG2 cells. MW167 showed no influences on the expression of these proteins. Compared with corresponding control, HES1 mRNA expression was decreased (P<0.05).〔Conclusion〕The inhibition rates were increased as the concentration increased. MW167 treatment could improve the cell proliferation of HepG2 cells.

Keywords: γ-secretase inhibitor; MW167; Notch pathway; hepatocellular carcinoma (HCC)

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，是严重威胁人类生命的重大疾病，是世界癌症相关死亡的第二大病因。目前，对肝癌相关信号传导通路的研究尚不明了，肝癌信号通路的深入研究对于肝癌的早期预防和治疗具有关键作用。Notch信号通路，是进化中高度保守的信号传导通路，在胚胎发育、细胞增殖凋亡和肿瘤形成等过程中发挥重要作用[1-2]。近年来研究[3-4]显示，Notch信号通路与肝癌的发生有密切关系。本文应用γ分泌酶抑制剂MW167阻断Notch信号通路，进而研究对肝癌细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株与药物

HepG2细胞株，购自中国科学院上海细胞生物所。γ分泌酶抑制剂MW167(Merck公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；引物(上海生工生物工程有限公司合成)；TRIzol(Invitrogen公司)；Notch1～4单克隆抗体(Cell signaling technology公司)；GAPDH单克隆抗体(上海康成生物工程公司)；HRP标记的羊抗大鼠二抗、羊抗兔二抗及羊抗小鼠二抗(上海威奥生物科技公司)；细胞裂解液(碧云天生物公司)；PVDF膜和ECL发光试剂盒(碧云天生物公司)。

1.2 细胞培养

将细胞密度为1×105/mL的HepG2细胞接种到含有体积分数为10%FBS的高糖型DMEM培养基中(5 mL)，在37 ℃、体积分数为5% CO2、完全饱和湿度条件下培养。倒置显微镜下观察细胞生长状况。取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 Western blotting检测Notch各受体蛋白表达

收集HepG2细胞，提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳、转膜，分别接Notch1～4单克隆一抗进行孵育、洗膜，接相应二抗进行孵育。实验中，一抗按1∶1 000比例稀释，二抗按1∶2 000比例稀释。加ECL发光，凝胶成像仪(Bio-Rad)拍照。

1.4 RT-PCR检测Notch1～4的表达

取对数生长期HepG2细胞约1×106个，提取总RNA，分光光度计检测基因浓度与纯度。引物序列见表1。反转录条件：30 ℃，10 min；42 ℃，30 min；99 ℃，5 min。RT-PCR操作按说明书进行。Notch1、Notch3的退火温度设定为60 ℃，Notch2退火温度设定为56 ℃，Notch4退火温度设定为58 ℃。质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检验。凝胶成像系统对结果进行分析。

1.5 Western blotting 检测MW167对Notch1～4蛋白表达的影响

取对数生长期HepG2细胞接种6孔板，每个孔内15×104个。70%的细胞融合后，用无血清培养基，饥饿培养24 h，加含不同浓度MW167(5、10、20μmol/L)的无血清培养基进行培养，二甲基亚砜(DMSO)处理设定为对照组。48 h后提取蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，操作同1.3。Quantity-One软件分析条带吸光度。实验重复3次，取平均值。

1.6 RT-PCR检测MW167对Notch下游基因HES1表达的影响

取对数生长期HepG2细胞接种6孔板，每个孔内15×104个。70%的细胞融合后，用无血清培养基，饥饿培养24 h，加含不同浓度MW167(5、10、20 μmol/L)的无血清培养基进行培养。48 h后提取总RNA，然后进行RT-PCR操作。HES1引物序列(表1)：5’-CCCTCCTCCTAAACTCCC-3’(上游引物)和5’-AATACAAAGGCGCAATCC-3’(下游引物)。扩增条件为94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1 min。28个循环。质量分数为2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测，凝胶成像系统分析结果。实验重复3次，取平均值进行分析。

1.7 MTT测定细胞增殖

取对数生长期HepG2细胞，细胞密度调整为1×104个/mL，接种于96孔板。每孔中加入200 μL细胞悬液。细胞贴壁后，换无血清培养基饥饿培养24 h，加含不同浓度MW167(5、10、20 μmol/L)的无血清培养基进行培养。每个浓度设对照组(DMSO处理)，空白调零组(只加培养基)，每组设3个复孔。在MW167处理培养48 h后，每孔分别加20 μL MTT溶液(5g/L)，继续孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，震荡溶解甲瓒后，设置酶标仪波长为490 nm，测定吸光度。实验重复3次，取均值。

1.8 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。t检验进行各组间均值比较，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 Notch受体蛋白各亚型在HepG2细胞的表达

Western blotting 实验显示，HepG2细胞中可检测到Notch受体蛋白各亚型的表达,见图1。RT-PCR实验证明，HepG2细胞中可检测到Notch1～4 mRNA的表达，见图2。

表1 引物序列

图1 HepG2细胞中Notch1～4蛋白的表达

1.Marker;2.GAPDH;3.Notch1;4.Noth2;5.Notch3;6.Notch4图2 RT-PCR法测定HepG2细胞Notch1～4 mRNA的表达量

2.2 γ分泌酶抑制剂MW167对Notch1～4 表达的影响

从图3可看出，不管是与培养基还是DMSO对照相比，不同浓度MW167对Notch1～4蛋白的表达没有显著影响。

2.3 MW167对Notch下游基因HES1表达的影响

MW167处理HepG2细胞后，RT-PCR法测定HES1 mRNA 的表达，与相应浓度的对照组相比，MW167处理组HES1 mRNA表达下降(P<0.05)。随着MW167处理浓度升高，HES1 mRNA表达抑制率逐渐升高(P<0.05)。见图4。

1.培养基对照；2.DMSO对照；3、4、5分别为5、10、20 μmol/L MW167加药组图3 不同浓度MW167作用下HepG2细胞中Notch1～4蛋白的表达

1、3、5分别为5、10、20 μmol/L M167处理；2、4、6分别为相应处理浓度的对照组图4 不同浓度MW167对Notch下游基因HES1表达的影响

2.4 MW167对HepG2细胞增殖的影响

MTT法检测结果显示，MW167处理的细胞，其吸光度高于对照组(P<0.05)，且随着MW167浓度的升高，细胞增殖率相应升高,见表2。

3 讨论

自1917年Morgan发现Notch基因以来，对Notch功能与结构的研究不断深入。从组织自我更新，胚胎发育到肿瘤的发生，Notch都发挥重要作用。在对肿瘤的研究[5]中发现，血液系统肿瘤及大部分器官的实体肿瘤，Notch基因的作用得到了认同。

表2 不同浓度MW167对HepG2细胞增殖的影响

注：*表示与对照组相比，存在显著差异(P<0.05)；#表示与5μmol/L相比，存在显著差异(P<0.05)。

Notch信号通路，通过相邻细胞间的相互作用，对细胞分化潜能可进行精确调控。相邻细胞通过Notch受体与配体的结合，传递Notch信号，从而扩大细胞间分子差异，对细胞命运起决定作用，最终影响器官的形成和形态发生。Notch信号，是相邻细胞之间的通讯，对细胞发育进行调控的重要通路。多种恶性肿瘤中，都可发现Notch信号通路调节异常。通过小RNA或γ分泌酶抑制剂技术阻断Notch1的活化，可抑制肿瘤细胞的生长。多项研究[6-8]表明，在非小细胞肺癌组织中存在Notch1蛋白高表达，并认为Notch1的高表达与非小细胞肺癌的发生及预后密切相关。

Notch信号通路可作用于肝内外胆管形态发育、肝内血管生成和肝细胞发育、再生等过程，同时可促进肝癌的发生和演变[9]。Notch1表达量在肝癌组织中明显高于正常和癌旁组织，且其与肿瘤的静脉侵犯、淋巴结转移及肿瘤分化密切相关。同时，研究[10-11]显示，肝癌组织中Notch 3 和Notch 4表达量上调，而肝炎组织和正常肝组织中未检测到其表达。本实验通过γ分泌酶抑制剂MW167处理正常培养的HepG2细胞，结果显示，MW167可部分阻断Notch信号通路，并可促进HepG2细胞的增殖。由此可知，Notch在肝癌中发挥抑癌作用。这与先前研究结果一致。还有专家研究[12]表明, Notch信号在体外和体内均能抑制肿瘤的生长，并且可能与肝癌细胞凋亡和周期停滞相关。

综上所述，本实验结果表明，HepG2细胞中可检测到Notch1～4蛋白和mRNA的表达，MW167处理可降低HES1 mRNA表达，MW167处理可促进细胞的增殖。

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[责任编辑时红]

TheinfluenceofblockingNotchsignalingpathwaybyγ-secretaseinhibitoronproliferationofHepG2cells

MENG Jiming1, TANG Hongna1, LIU Xiaoming1, WANG Chaoyang1,2, REN Xuequn

1. Department of Surgery, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 2. Center for Evidence-Based Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475000, China; 3. Center for Translational Medicine, Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475000, China.

R73-3

A

1672-7606(2017)03-0187-04

2016-11-17

孟继明(1971- )，男，河南睢县人，主任医师，硕士生导师，研究方向：普外科疾病的诊断与治疗。