李自波，姚静静，杜振华， 杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

新加大黄附子汤对小鼠原位移植肝癌的治疗作用

李自波，姚静静，杜振华， 杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

〔目的〕 观察新加大黄附子汤对小鼠原位移植肝癌是否具有治疗效果。〔方法〕 建立小鼠原位移植肝癌模型，造模小鼠随机分组，次日用新加大黄附子汤灌胃开始治疗，观察小鼠的生存状态，用药40 d后测量小鼠肝脏的质量，计算肿瘤的体积，检测血清 CEA肿瘤标志物, HE染色检测小鼠肝脏病理变化。〔结果〕 模型组小鼠原位移植肝癌的致瘤率为95%，小鼠自主活动、体温都偏低，40 d存活率只有45%，肿瘤体积较大；新加大黄附子汤治疗的小鼠致瘤率为75%，小鼠的自主活动、体温都高于模型组，40 d存活率达到70%，肝脏肿瘤体积明显小于模型组(P<0.05)；CEA肿瘤标志物检测发现给药组含量明显低于模型组(P<0.05)。〔结论〕新加大黄附子汤对小鼠原位移植肝癌具有治疗作用。

新加大黄附子汤；肝癌；原位移植；治疗作用

Abstract: 〔Objective〕To observe therapeutic effect of the new added Dahuangfuzi Decoction on orthotopic liver cancer in mice.〔Methods〕The mice were divided into different groups randomly after orthotopic liver cancer model in mice was established.The mice were received the new added Dahuangfuzi Decoction via intragastric administration at the second day following tumor inoculation. The survival status of mice was observed every day. The tumor volume and liver weight were measured after 40 days. The concentration of CEA in the serum was detected and the liver pathological changes were observed by HE staining.〔Results〕The tumorigenicity rate in the model group was 95%.The autonomic activities and the temperature of the model group were lower than the therapeutic group, and the survival rate was only 45%. The tumorigenicity rate in the therapeutic group was 75% and the survival rate was 70%. Compared with the model group, the concentration of CEA and tumor volume in the therapeutic group were obviously lower(P<0.05).〔Conclusion〕The new added Dahuangfuzi Decoction have therapeutic effect on orthotopic liver cancer in mice.

Keywords: the new added dahuangfuzi decoction; liver cancer； orthotopic; therapeutic effect

肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，初期症状并不明显，晚期主要表现为肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等症状。由于肝癌起病隐匿，发展迅速，在临床上得到确诊往往已经是晚期。我国的肝癌通常是以肝炎和肝硬化为背景的[1]，积极探寻符合我国国情，高效并且不良反应少的系统化中西医联合治疗方案是肝癌治疗的重要课题。中医认为，肝癌的病因及病理为外受寒邪、损伤脾胃、肝气郁滞、气滞血瘀、结而成积[2]，所以，对于肝癌的治疗应以解毒活血和补虚扶正相结合。

在我国，中医治疗肝癌有着悠久的历史和丰富的经验。春秋战国时期的《黄帝内经》、《张氏医通》对肝癌的病理和症状都有明确的描写。对于治疗肝癌的复方中药也有很多，例如全虫散、退黄消涨方、双半煎等。中医能够根据肝癌的不同体征，合理配伍中药，从而最大限度地保护肝功能、减少病发症、提高患者生命质量。本研究采用大黄、附子、肉桂、吴茱萸组成的新加大黄附子汤，通过用原位移植肝癌小鼠模型来评价新加大黄附子汤对肝癌的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

昆明种小鼠45只，雄性，6周龄，体质量(20～25)g，由河南省医学实验动物中心提供。小鼠肝癌细胞株H22，由中国科学院上海细胞生物研究所提供。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂 戊巴比妥钠、多聚甲醛、苏木精、伊红(美国Sigma)；医用OB吻合胶(开封市天济大药房)；大黄、附子、肉桂、吴茱萸(开封市天济大药房)。

1.2.2 仪器 电子天平(上海精密仪器有限公司天平仪器厂)；电子体温计(香港泰克曼电子仪器有限公司)；ZH-YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；正置显微镜XDS-500D(奥林巴斯，日本东京)；KD202C转轮式切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)

1.3 新加大黄附子汤的准备

称取大黄20克，附子、肉桂、吴茱萸各10 g(即按照2∶1∶1∶1进行组方)，加入20倍水，浸泡30 min，然后煎煮30 min，共煎煮3遍。将 3 次的水煎液综合，加热浓缩至 200 mL，使水煎液浓度为1 g/4 mL。

1.4 小鼠原位移植肝癌模型的建立

取腹水型H22细胞，配制成浓度为1×107的细胞混悬液，每只小鼠腋下接种0.2 mL，在一周后肿瘤生长至直径1 cm时进行原位移植，在无菌状态下取出瘤组织，放在生理盐水中去除外周纤维组织、坏死组织及血管，然后将其切成2 mm3瘤块。将40只小鼠用0.005 g/mL的戊巴比妥钠溶液，每只0.1 mL/10 g腹腔注射使其麻醉，小鼠仰卧位固定于鼠板，消毒之后，沿腹中线剪开，露出肝脏，用眼科沙眼铲在肝左外叶中间部位沿肝叶平面约20度角轻轻戳一个约3 mm深度的隧道,用弯聂夹取小瘤块,送入隧道内[4],用医用OB吻合胶局部外用止血，最后缝合伤口，并涂抹金霉素眼膏防止伤口感染。

1.5 分组与给药

在小鼠手术后24 h，将40只小鼠随机分为2组，模型组和给药组各20只。模型组，每天用灌胃法以0.2 mL/10 g蒸馏水给小鼠灌胃。给药组， 每天用灌胃法以0.2 mL/10 g的剂量给小鼠5 g/kg 的新加大黄附子汤，每次灌喂前都要称重，连续给药40 d。

1.6 日常观察

每日密切观察两组小鼠的情况，测量小鼠的体温和自主活动；对40 d内死亡的小鼠的死亡日期进行统计。

1.7 指标测定

处理小鼠前，统计小鼠的存活数；脱臼法处理小鼠，收集血液，检测癌胚抗原含量；解剖取肝脏，观察小鼠肝脏长瘤情况，称重、拍照；用游标卡尺测量瘤的长径(a)和短径(b)，根据公式计算出肿瘤的体积[3]：肿瘤体积=a×b2/2；将收集的小鼠肝脏做好标记，浸泡在体积分数为4%多聚甲醛溶液中，2 d后用乙醇脱水，二甲苯透化，石蜡包埋，然后切5μm片做HE染色，观察小鼠肝脏组织的病理情况。

1.8 统计学分析

应用SPSS 18.0软件对实验数据进行统计学分析,采用单因素方差分析和t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠肝癌原位移植瘤的影响

从图1中可以看出，小鼠肝脏接瘤处有乳白色结节，肿瘤形态相对规则，呈圆形或椭圆形，肿瘤有包膜或薄膜不完整；对小鼠肿瘤组织的体积进行计算，模型组的肿瘤平均体积为2.795 cm3，给药组的平均体积为1.436 cm3。从图2中可以看出，给药组的肿瘤体积小于模型组，且有显著性差异(P<0.01)；模型组肝脏的平均质量为6.867 g，给药组的平均质量为3.807 g，给药组的肝脏质量小于模型组，且有显著性差异(P<0.05)。见图3。

2.2 对血清中CEA肿瘤标志物的影响

模型组小鼠CEA肿瘤标志物的含量为2.807 mg/L，给药组小鼠CEA肿瘤标志物的含量为2.341 mg/L，从图4可看出给药组的CEA肿瘤标志物的含量小于模型组，且有显著性差异(P<0.05)。

图1 小鼠肝癌生长情况

图2 小鼠的肿瘤体积

图3 小鼠的肝脏质量

2.3 对小鼠存活率的影响

从图5中可以看出小鼠在第8天开始出现死亡，与模型组相比给药组的存活时间更长，在给药40 d时，模型组的存活率为45%，给药组的存活率为70%。

2.4 小鼠肝组织病理学HE染色

对小鼠肝脏的非接瘤区进行HE染色，发现模型组多出现细胞核密集的区域，细胞核较大，而且有炎症渗出物，而给药组细胞核密集的区域相对较少，炎症细胞浸润明显减少。见图6。

图4 血清CEA的含量

图5 小鼠的的存活时间

图6 小鼠肝组织病理学HE染色

2.5 对小鼠自主活动、体温的影响

如图7所示，两组小鼠的自主活动都呈现出下降趋势，但给药组的下降趋势更加缓慢；在图8中，可以看出给药组的腹部温度明显高于模型组，中药复方水煎液对小鼠体温有一定的调节作用。

3 讨论

小鼠肝癌细胞株(H22)是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一,广泛应用于小鼠肝癌动物模型的复制。本实验采用昆明鼠腋下接种腹水型H22细胞，再将肿瘤组织移植到正常小鼠肝脏内，建立小鼠原位移植肝癌模型[4]。原位移植肝癌小鼠模型能更好地模仿肝癌在体内生长的微环境，更适用于肝癌侵袭和转移的研究。

图7 小鼠自主活动的变化

图8 小鼠腹温的变化

大黄附子汤载于 《金匮要略·腹满寒疝宿食病脉证》篇,由大黄、附子、细辛组成，具有温里散寒,通便止痛的功效。现代药理研究[5]发现,大黄附子汤在治疗胆囊炎中，具有减少疼痛，消退黄疸，减轻肝肾衰竭的症状，凡属素体阳虚,寒邪内聚所致的“阴结 ”杂症,运用该方都可以得到显著的治疗效果。中医[6]认为，“阳虚寒凝”是恶性肿瘤的关键发病机制，而新加大黄附子汤去除细辛避免了它对肾功能的损害。肝癌发病时通常寒邪凝滞引起疼痛，复方中新加的肉桂、吴茱萸都属于温里药，具有散寒、止痛的作用，能对抗体内的寒邪，同时又能起到补阳、回阳的作用。本研究通过用肝癌小鼠模型评价新加大黄附子汤对肝癌的治疗作用，发现新加大黄附子汤可以改善荷瘤小鼠精神状态，抑制肿瘤的生长，减少肿瘤的浸润，从而延长荷瘤小鼠的存活时间。

综上所述，新加大黄附子汤在动物实验方面已经得到了显著的治疗效果，可能成为临床上治疗肝癌的好方剂。

[1] 陈建国.中国肝癌发病趋势和一级预防[J].临床肝胆病杂志，2012，28(4)：256-258.

[2]王睿林，王立福，王仲霞,等.中药治疗肝癌研究现状[J].传染病信息，2012，25(3)：189-190.

[3]Iwanuma Y, Chen F A, Egilmez N K, et al. Antitumor immune response of human peripheral blood lymphocytes coengrafted with tumor into severe combined immunodeficient mice[J]. Cancer research,1997,57(14):2937-2942.

[4]韩克起,顾伟,胡侠，等.小鼠肝癌原位移植模型的建立及生物学特性[J].中西医结合学报,2004,2(5):374-375.

[5]梁晓夏,张保国,刘庆芳.大黄附子汤现代药效学研究与临床运用[J].中成药，2008,30(11):1670-1673.

[6]郑亚秋,耿胜男,孟明静,等.川乌对小鼠二阶段皮肤乳头状瘤的抑制作用[J].河南大学学报(医学版),2016,35(1):5-8.

[责任编辑时红]

ThetherapeuticeffectofthenewaddedDahuangfuziDecoctiononorthotopiclivercancerinmice

LI Zibo , YAO Jingjing ,DU Zhenhua, DU Gangjun

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

R735.7

A

1672-7606(2017)03-0156-04

2016-11-17

国家自然科学基金项目(81173094)

李自波(1993-)，男，河南卢氏人，在读研究生，研究方向：中药药理学与肿瘤药理学。