姚静静，杜振华，李自波，杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

新加麻黄附子细辛汤对小鼠Lewis原位肺癌的治疗作用

姚静静，杜振华，李自波，杜钢军

河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004

〔目的〕 观察新加麻黄附子细辛汤对小鼠Lewis原位肺癌是否有治疗作用。〔方法〕 Lewis肺癌细胞滴气管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，次日用新加麻黄附子细辛汤(麻黄∶细辛∶附子∶半夏=1∶2∶2∶5)灌胃开始治疗，观察各组小鼠的生存状态、肿瘤数目及致瘤率；HE染色法观察肺病理变化。〔结果〕 用Lewis肺癌细胞滴气管建立的Lewis原位肺癌模型8周后致瘤率为91%，肿瘤数目平均为17±3.05；新加麻黄附子细辛汤在相同时间内致瘤率为69%，肿瘤数目平均为12±1.53。HE染色结果表明：正常组小鼠肺部切片未见癌细胞；模型组小鼠肺组织间聚集有片状核大深染的肿瘤细胞，出现明显癌变，细胞核与细胞质比例失常，细胞核密集，空洞逐渐变小；新加麻黄附子细辛汤组细胞核密集区相对较少。与模型组比较，新加麻黄附子细辛汤组体质量明显上升，摄水食量增加，自主活动增多，精神状态良好。〔结论〕新加麻黄附子细辛汤能够延长Lewis原位肺癌模型小鼠的生存时间，对小鼠Lewis原位肺癌具有治疗作用。

新加麻黄附子细辛汤；肺癌；Lewis细胞；治疗作用

Abstract: 〔Objective〕To observe the effect of the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction on orthotopic Lewis lung cancer in mice.〔Methods〕Orthotopic Lewis lung cancer model in mice was established by injecting Lewis lung cancer cells into trachea. The next day, the mice received the new added Mahuang Fuzi Xixin Decoction[ephedra∶Asarum∶aconite∶Pinellia =1∶2∶2∶5] via intragastric administration.The survival status of mice, tumors number and tumorigenicity were observed. The lung pathological changes were observed by HE staining.〔Results〕The tumorigenicity rate in the model group was 91% at 8 weeks and the average tumors number was 17±3.05. The tumorigenicity rate in the new added Mahuang Fuzi Xixin Decoction at the same time was 69% and the average tumors number was 12±1.53. HE staining showed that there were no cancer cells in lung sections in normal mice. In the model group, the tumor cells were flaky and deeply stained. The proportion of nucleus and cytoplasm was abnormal, the nucleus was dense, and the cavity became smaller. There was relatively few dense nuclei in the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction group. Compared with the model group, the body weight in the new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction group significantly increased, water intake increased, and the mental state was good.〔Conclusion〕The new-added Mahuang Fuzi Xixin Decoction could prolong the survival time of mice with Lewis lung cancer and had therapeutic effect on orthotopic Lewis lung cancer in mice.

Keywords: A new added of Mahuang Fuzi Xixin Decoction; lung cancer; Lewis cells; therapeutic effect

目前，在肺癌的动物实验中，大多使用小鼠皮下种植肺癌细胞系，在皮下形成肺癌肿瘤结节的动物模型，如孙秋艳等[3]用体外培养的 Lewis 细胞悬液注射于小鼠左侧腋下，形成皮下肿瘤。这种肺癌模型成瘤率高，基本可以达到100%，并且周期短，适合肿瘤的活性筛选和评价。但是，皮下接种瘤脱离了原位微环境的影响，往往和临床实际情况不符[4]。为了保证动物模型和临床结果的一致性，本实验拟采用Lewis 肺癌细胞滴气管，建立小鼠Lewis原位肺癌模型，观察新加麻黄附子细辛汤对肺癌的治疗作用。

1 材料与仪器

1.1 实验细胞

小鼠 Lewis 肺癌细胞( LLC)，购于中科院上海细胞库。

1.2 实验动物

昆明小鼠，雄性，由河南省医学实验动物中心提供。

1.3 药品及试剂

新加麻黄附子细辛汤制备方法：分别称取原药材麻黄10 g、细辛20 g、附子20 g、半夏50 g(即按照1∶2∶2∶5进行组方)，混合后自来水冲洗干净，加水量没过药面，浸泡30 min，中火煎煮，时间30 min，取水煎液。重复上述过程，共煎煮 3 次。合并3次滤液加热浓缩至400 mL，使水煎液浓度为10 g/kg。

试剂包括：体积分数为10%的 胎牛血清、DMEM培养基、质量分数 0.25% 的胰酶(美国Hyclone公司产品)、生理盐水、戊巴比妥钠、PBS缓冲液、苏木精、盐酸酒精、伊红。

1.4 实验仪器

CO2细胞培养箱(赛默飞世尔科技有限公司)；HDL超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；电子体温计(泰克曼电子仪器有限公司)；YSL-1A多功能小鼠自主活动记录仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)；KD202C转轮式切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将小鼠 Lewis 肺癌细胞置于含体积分数10%的胎牛血清及 DMEM完全培养液中,在37 ℃、体积分数为5 %的CO2培养箱中培养,2～3 d 更换1次培养液，质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化传代。待细胞达到所需量时，显微镜下计数，调至所需要浓度。

2.2 造模

先以0.2 mL(约 1×106个细胞)接种于昆明小鼠腋下，20 d 后以颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，体积分数为75%的酒精浸泡消毒，无菌条件下剥离肿瘤组织，剪碎后用预冷的无菌生理盐水洗净，用组织研磨器研碎，制成瘤细胞悬液，1 000 r/min,5 min,离心2次，加入生理盐水调整细胞浓度为 5×106个/mL。体积分数0.5%的戊巴比妥钠溶液，按0.1 mL/10 g体质量剂量对昆明小鼠进行腹腔注射麻醉，取上述瘤细胞悬液10 μL 滴入昆明小鼠气管中。

我坐在她怀里，喂她吃菜，她坐我腿上，勾着我脖子，让我跟她喝交杯酒。她兴致勃勃，又唱又跳。我说，你小声点儿，别把陆茂本他们招来。她笑着说，我不吱声，他们就不来吗？我有点不痛快，问，难道他们来过？

2.3 分组及给药

造模后将36只昆明种雄鼠随机分为3组，每组12只，分别为：新加麻黄附子细辛汤组(即复方组)、模型组、正常组。复方组及模型组次日开始给药，复方组以10 g/kg灌胃给药，2次/d；模型组以0.2 mL/10 g蒸馏水灌胃，2次/d。正常组按正常方式饲养。

2.4 检测指标及方法

实验开始后各组动物每周记录体质量、水食量、自主活动等变化情况，以此对比小鼠的活跃程度。实验结束后，小鼠摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠，解剖分离得到肺组织，计算小鼠肺组织表面的肿瘤数目及致瘤率。

2.5 病理检测

小鼠处死后，取各组小鼠肺组织用体积分数为4%的多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片、HE染色、乙醇脱水、透明、封片，显微镜下观察肺组织病理学变化。

2.6 统计学分析

3 实验结果

3.1 对小鼠体质量变化的影响

正常组小鼠体质量明显增加，模型组小鼠体质量呈逐渐减轻的趋势，小鼠状态明显下降，复方组小鼠体质量相对平稳。见图1。

图1 小鼠体质量变化趋势

3.2 对小鼠水食变化的影响

与正常组相比，模型组小鼠食欲欠佳，饮水量和饮食量都相应减少，复方组食欲正常，基本和正常组保持相平。见图2、图3。

图2 小鼠饮水量的变化

图3 小鼠饮食量的变化

3.3 对小鼠自主活动的影响

各组小鼠的自由活动次数随着试验时间的增长而逐渐减少，复方组小鼠的自由活动次数虽有所下降，但是仍然较模型组高。说明复方组小鼠比模型组精神状态好，具有显著性差异。见图4。

3.4 新加麻黄附子细辛汤对小鼠Lewis原位肺癌肿瘤数目和致瘤率的影响

图5可见，正常组肺组织鲜红；Lewis 原位肺癌模型组有明显的肺损伤，肿瘤区域较多；复方组肺组织表面比模型组肿瘤数减少。

用Lewis肺癌细胞滴气管建立的Lewis原位肺癌模型8周后肿瘤数目平均为17±3.05，致瘤率为91%；而复方组在相同时间内肿瘤数目为12±1.53，致瘤率为69%，具有显著性差异(P<0.05 )。表明新加麻黄附子细辛汤对小鼠Lewis原位肺癌具有治疗作用。

图4 小鼠自主活动的变化

图5 昆明小鼠肺组织变化

3.5 病理学检测结果

将各组小鼠的肺组织切片进行HE染色，在显微镜下观察到：正常组小鼠肺部切片未见癌细胞，结构排列整齐；模型组小鼠肺组织间聚集有片状核大深染的肿瘤细胞，出现明显癌变，出现核裂解现象，细胞核大而清楚，核仁增大，细胞核与细胞质比例失常，细胞核密集，空洞逐渐变小；复方组细胞核明显小于模型组，有少量的肿瘤细胞进入，说明新加麻黄附子细辛汤能明显改善Lewis肺癌模型肺组织的病理变化。结果见图6。

图6 昆明种小鼠肺癌组织病理结果

4 讨论

中药复方在抗肿瘤方面发挥着日益重要的作用，而肺癌作为最主要和最常见的肿瘤，许多复方已在其治疗或辅助治疗过程中体现出了很大的应用价值[5]。寒邪是六淫邪气之一，与肿瘤的发病机制关系密切[6]。《伤寒论》中记载麻黄附子细辛汤，方中麻黄解表发汗，除太阳表之寒邪；制附子扶阳温里暖少阴之里；细辛温经通阳，入里佐附子温经通少阴，助阳散里寒，出外助麻黄发汗温经解表散寒，具有扶正解表、散寒止痛的功效[7]。虽然麻黄附子细辛汤有较强的散寒作用，但化痰作用偏弱。为了增强化痰作用，在麻黄附子细辛汤基础上增加半夏，半夏具有燥湿化痰的功效，和肺癌的发病机制相吻合，诸药合用对肺癌具有良好的治疗作用。

本研究通过麻黄细辛附子汤加半夏组成的新加麻黄附子细辛汤来研究其水煎液对小鼠Lewis原位肺癌的治疗作用。研究表明，模型组小鼠的肿瘤数目和致瘤率明显比新加麻黄附子细辛汤多，具有显著性差异。在生存状态方面，与正常组相比，模型组小鼠体质量下降，食欲欠佳，饮水、饮食量减少，精神状态不好，活动减少。复方组比模型组体质量明显上升，摄水食量有所增加，精神状态良好。HE染色结果表明，新加麻黄附子细辛汤组肺组织间肿瘤细胞明显比模型组少。

综上所述，用Lewis肺癌细胞滴气管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，具有较好的成瘤率及转移特性。新加麻黄附子细辛汤是治疗肺癌的一个好方剂。

[1] Bugiantella W, Cavazzoni E, Graziosi L, et al. Small bowel metastasis from lung cancer: a possible cause of acute abdomen. Case report and literature review[J]. G Chir,2011,32(3): 120-122.

[2] 张彩虹, 杜忠海, 孙长岗. 中药复方制剂治疗肺癌细胞分子学实验研究进展[J]. 实用中医内科杂志, 2011,25(6):26-31.

[3] 孙秋艳,刘艳,汪茜,等.绿原酸对Lewis肺癌小鼠及人A549肺癌的实验研究[J].华西药学杂志,2010,25(5):536-538.

[4] 李宁,张晓晔,蒋中秀,等.小鼠Lewis肺癌原位模型的建立[J].中国实验动物学报,2014,22(5):79-83.

[5] 魏文静,刘同祥,张冠庆,等.中药复方抗Lewis肺癌药理作用研究进展[J].药物评价研究,2013,36(2):138-141.

[6] 赵令竹,鞠宝兆.寒邪与肿瘤关系探要[J].中国医药导报,2015,12(25):104-106.

[7] 邓玉艳,伍德军.麻黄附子细辛汤治疗肺癌疼痛30例[J].河南中医,2012,32(10):1279-1280.

[责任编辑时红]

ThetherapeuticeffectofthenewaddedMahuangFuziXixinDecoctiononOrthotopicLewislungcancerinmice

YAO Jingjing ,DU Zhenhua, LI Zibo, DU Gangjun

Intitute of Pharmacy, Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

R734.2

A

1672-7606(2017)03-0160-04

2016-11-17

国家自然科学基金项目(81173094)

姚静静(1993-)，女，山西晋城人，在读研究生，研究方向：中药药理学与肿瘤药理学。