吴文亮，黄建安，刘仲华*，杨新河，袁 勇，黄 浩，杨文波

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128；2. 湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125；3.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶业集团股份有限公司，湖南 长沙 410126）

LDLR激动剂模型的建立及上调LDLR功能的黑茶品类筛选

吴文亮1,2，黄建安1，刘仲华1*，杨新河3，袁 勇4，黄 浩2，杨文波2

（1.湖南农业大学 茶学教育部重点实验室，国家植物功能成分利用工程技术研究中心，植物功能成分利用协同创新中心，湖南 长沙 410128；2. 湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125；3.湖北工程学院 生命科学技术学院，湖北 孝感 432000；4. 湖南省茶业集团股份有限公司，湖南 长沙 410126）

建立低密度脂蛋白受体（Low density lipoprotein receptor ,LDLR）激动剂药物筛选模型，并用该模型筛选出具有上调LDLR功能的黑茶品类。合成LDLR启动子片端（189bp），克隆入含有萤火虫荧光素梅报告基因的pGL3-basic载体中，构建了重组报告基因质粒pGL3-LDLR，以pRL-TK为内参质粒，瞬时转染人肝癌细胞HepG2；以降脂药物辛伐他汀作为阳性对照物，优化反应条件，再应用该模型对8种黑茶水提取物进行了初步筛选。结果表明，辛伐他汀对荧光素酶的表达具有较强的诱导作用，且呈一定剂量的依赖性，Z′因子为0.72，表明该模型具有很好的灵敏性和稳定性，成功地建立了靶向LDLR转录活性的双报告基因筛选体系，并发现待测黑茶均有一定的激动活性，其中金花天成茶对模型的激活值最高，激活值达1.761。

低密度脂蛋白受体；双荧光素酶报告基因；药物筛选模型；黑茶

低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein receptor, LDLR) 是一种表达丰富的膜糖蛋白，在肝细胞中含量较多。血浆中大部分胆固醇被肝细胞表面的LDLR清除，与脂代谢关系密切[1]。人类的冠心病、动脉粥样硬化等疾病与LDLR结构及功能的紊乱有关联[2]，因此上调LDLR的表达成为治疗高胆固醇血症等疾病的药物靶标。

我国边疆少数民族同胞长期食用高脂食物，却少见患肥胖和高脂血症疾病的报道，黑茶是边疆游牧民族生活必需品，具有悠久的饮用历史，有“宁可三日无食，不可一日无茶”之说，可见黑茶对他们的重要性。现有研究表明黑茶对调节高脂血症具有显著的效果[3-6]，但对黑茶在上调LDLR功效方面的研究还鲜见报道。本研究是以LDLR启动子为靶点建立新型降血脂药物的筛选模型，筛选出具有上调LDLR功能的黑茶品类，并为黑茶的综合开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、细胞株和质粒

HepG2购自中国科学院上海细胞库；E.coli DH5α（用于质粒DNA的遗传操作）由本实验室提供；引物及含LDLR基因的启动子序列质粒pLDLR由北京三博远志生物公司合成；pRLTK载体为含有启动子的海肾荧光素酶编码基因的内参质粒，pGL3-Basic为含无启动子的萤火虫荧光素酶编码基因报告基因载体，均购自Promega公司。

1.1.2 黑茶

茯砖茶（2010年），湖南益阳茶厂；千两茶（2010年），天尖茶（2010年），湖南省白沙溪茶厂有限责任公司；六堡茶（2010年），广西梧州茂圣茶业有限公司；青砖茶（2010年），湖北赵李桥茶厂；金花天成茶（2010年），湖南省安化县晋丰厚茶行有限公司；金尖茶（2010年），四川吉祥茶业有限公司（雅安市茶厂）；普洱熟茶（2010年），云南龙润茶业集团。

1.1.3 药品与试剂

限制性内切酶Bgl II、HindⅢ，TOYOBO公司产品；Pfu-DNA聚合酶、T4DNA连接酶，Fermentas公司产品；转染试剂Lipofectamine™2000，Invitrogen公司产品；双荧光素酶检测试剂盒，Promega公司产品；大型质粒抽提试剂盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （10），Qiagen 公司产品；质粒小提试剂盒，北京天根公司产品；二甲基亚矾（DMSO），Amreso公司产品；辛伐他汀，上海施贵宝产品；OPTi-MEM，Gibco公司产品。

胰酶、L-谷氨酞胺，Gibco公司产品；DMEM培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，Gibco公司产品。

1.1.4 仪器

PCR扩增仪（德国Biometra公司）；Varioskan Flash多功能读数仪（Thermo Scienti fi c）。

1.2 试验方法

1.2.1 重组质粒pGL3-LDLR的构建

据文献[1]报道，人LDLR基因启动子最大活性调控区域，合成189bp片段的 LDLR启动子（其序列－187～＋2）并构建在pGL3-Basic质粒上，用PCR扩增得到大量该片段，利用Primer设计上游引物P1：GGTAGATCTCTCGA GGCCTGCCCTGGCGACACT （下划线表示Bgl II酶切位点）和下游引物P2：CCCAAGCTTGC CCACGTCATTTACAGCATTTCA（下划线表示Hind III酶切位点）扩增靶基因。PCR反应体系以质粒pLDLR为模板，反应条件为94℃预变性2 min；94℃变性10 s，61℃退火10 s，72℃延伸1 min（30个循环）；72℃再延伸20 min。

将PCR扩增的目的片段与经过相同双酶切的pGL3-Basic质粒相连，将LDLR基因启动子序列定向插入到质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建重组质粒pGL3-LDLR，转化大肠杆菌DH5α受体菌，然后做菌落PCR鉴定重组质粒pGL3-LDLR；将鉴定为阳性的菌液加入含氨苄LB液体培养基培养，提取质粒，用BglII /Hind III双酶切鉴定重组质粒并进行序列测定。

1.2.2 细胞培养与转染

10%胎牛血清的DMEM培养基用于HepG2细胞株培养，转染前用胰酶消化。参考Lipofectamine 2000转染试剂盒提供的方法进行细胞转染，具体方法为：96孔培养板每孔接入3×105个生长状态良好的HepG2细胞，待细胞贴壁生长至90%时开始转染，按操作说明加入适量的质粒和脂质体[7]。

1.2.3 荧光素酶活性的测定

细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光素酶双报告基因检测试剂盒，在酶标仪下自动检测相对荧光素酶活性（relative luciferase unit，RLU），即萤火虫萤光素酶活性值与海肾萤光素酶活性值的比值，海肾萤光素酶为内参[8]。

荧光素酶的诱导表达率=阳性对照物的RLU/阴性对照物（DMSO）的RLU。

1.2.4 模型稳定性的考察

细胞瞬时转染后，设置阳、阴性对照各30次试验，辛伐他汀按最佳浓度加入给药孔中，24 h后测RLU。

Z'因子值大于0.4时，表示该筛选模型具有可重复性及很高的灵敏度[9]，本试验公式中的Luc值= RLU

1.2.5 黑茶水提物的初步筛选

应用已建立的模型对8种黑茶水提取物进行初步筛选，以0.2 μg/mL浓度的辛伐他汀作为阳性对照，0.1%DMSO为阴性对照[7,10-11]，24 h后测定细胞内的Fluc与Rluc的比值即RLU，并计算激活模型的激活值（即实验组RLU与阴性对照组RLU的比值），当待测黑茶水提取物的激活值≥1即可判定为阳性结果[12-14]。

1.2.6 数据处理与分析

原始数据用 SPSS 18.0 统计软件进行处理，所有数据均以平均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析。*P＜0.05为差异有统计学意义，**P＜0.01为显著统计学差异。

2 试验结果

2.1 LDLR启动子的克隆

以pLDLR为模板，PCR扩增LDLR启动子。电泳分析如图1所示，泳道2有一条210 bp带，这与含有双酶切位点的LDLR启动子大小相符。

水分状况是影响植物分布、生长发育的环境因子，植物对环境水分的需求有其临界值和最高点。土壤过湿，水分处于饱和状态，土壤含水量超过田间最大持水量，这种现象成为湿害。在农业生产上，植物的湿害不如干旱普遍，但是在某些地区或某个时期，湿害可能造成严重的危害。如在雨量大、排水不良或地下水位过高的土壤和低洼、温室设施等常会出现水分过多、空气湿度过大造成对植物的危害。

图1 LDLR启动子扩增结果Fig.1 Ampli fi cation results of LDLR promoter

2.2 重组质粒pGL3-LDLR的构建

构建重组质粒pGL3-LDLR后，转化大肠杆菌DH5α，做菌落PCR鉴定重组质粒pGL3-LDLR，结果如图2，第2、3泳道内的PCR产物与第4泳道阳性对照质粒pLDLR扩增的LDLR启动子大小一致，为210 bp左右。

图2 重组质粒pGL3-LDLR鉴定结果Fig.2 PCR identi fi cation of recombinant plasmids pGL3-LDLR

将鉴定为阳性菌落的菌液接种于含Amp的LB液体培养基中培养，提取质粒，双酶切重组质粒pGL3-LDLR，琼脂糖凝胶电泳。由图3可见：第2、3泳道的酶切产物均出现大小两个片段，大片段与pGL3-Basic（4818bp）大小一致，小片段与LDLR启动子一致。

将重组质粒pGL3-LDLR送往上海生工公司测序，测序结果与报道的序列[1]一致，由此获得pGL3-LDLR重组质粒。

2.3 阳性药物辛伐他汀对细胞增殖功能的影响（CCK8法）

将HepG2细胞接种于96孔板，完全贴壁后用不同浓度的辛伐他汀处理细胞24 h后，采用CCK8法在450 nm处检测吸光度（OD值），每个样品重复5次。结果如图4所示：在2×10-4～2 μg/mL范围内，OD值与对照组相比差异无显著性（P＞0.05），说明在此剂量范围内辛伐他汀对细胞增殖无影响。辛伐他汀在20 μg/mL浓度时，OD值与对照组相比具有显著性差异（*P＜0.05）。

图3 重组质粒的双酶切分析Fig.3 Restriction enzymatic analysis of recombinant plasmid

图4 辛伐他汀对HepG2细胞增殖的影响Fig. 4 The effect of simvastatin on the proliferation of HepG2 cells

图5 不同质粒比对转染效率的影响Fig. 5 The effect of different ratios of plasmids on transfection ef fi ciency

2.4 共转染过程中质粒比的优化

2.5 模型的灵敏性

加入 2×10-4、 2×10-3、 2×10-2、 2×10-1、2 μg/mL系列浓度的辛伐他汀，24 h后测定细胞内的RLU，如图6所示：各组值与对照组相比RLU值差异显著（**P＜0.01），萤光素酶基因表达与辛伐他汀的浓度有高度关联性，诱导表达率与辛伐他汀浓度在一定程度上呈剂量依赖性，体现了浓度依赖性，说明该模型具有较高的灵敏度。

2.6 模型的稳定性

为评估该模型是否稳定，在96孔板上同时重复阳、阴性对照各30次，按上述最佳实验条件进行，结果如图7所示：

图6 不同浓度的辛伐他汀对荧光素酶表达率的影响Fig .6 The effect of different concentrations of simvastatin on induction rate of luciferase expression

图7 96孔板Z′因子检测Fig.7 Z′factor determination in 96-well plate forma

Z′因子=0.72，表明实验结果稳定，阳性和阴性实验结果区别明显，筛选模型的分辨率较高。在30次的重复实验中，偶尔出现假阳性和假阴性，这是大规模筛选中难以避免的。

2.7 阳性样品的筛选

对8种黑茶水提取物进行初步筛选，以检测它们是否为LDLR模型的激动剂，结果如表1，8种黑茶水提取物激活值均≥1，其中6种样品的激活值达1.5以上，分别为茯砖茶、金花天成茶、普洱熟茶、青砖茶、天尖茶和六堡茶，其中金花天成茶对模型的激活值最高，为1.761。金尖茶和千两茶对模型也呈现一定的激动活性，激活值接近1.5。

3 讨论

据文献[15-16]报道，细胞内的胆固醇负反馈调节LDLR基因转录，当细胞内胆固醇浓度降低时，胆固醇与SRE位点（结合在LDLR基因启动子）的结合蛋白结合，进而上调LDLR的表达，使细胞摄取胞外胆固醇，血浆正常胆固醇水平正是在这种反馈调节机制下进行。本研究合成了LDLR启动子片端，构建重组报告基因质粒pGL3-LDLR，通过转染至人肝癌细胞HepG2，并对各种反应条件进行了优化，成功地建立了靶向LDLR转录活性的双报告基因筛选体系。

表1 8种样品对LDLR模型的影响（mean±SD，n=5）Table1 The effect of eight samples on the activity of LDLR models（mean±SD，n=5）

筛选体系稳定性的Z'因子与两个参数有关，其一是阳性对照和阴性对照平均值的差值，该值越大，说明试验对样品的活性反应越灵敏；其二是阳性对照和阴性对照标准差的和，此值越小则说明试验稳定，可重复性好，试验的精确度高，数据越可靠[9]。因此，具有可重复性及高灵敏度的筛选模型Z'因子值一般要求大于0.4，这样可有效的减少假阳性和假阴性率[9]。为确保试验数据的可信度，本次筛选所有板的Z'因子均大于0.4，符合结果分析要求。

为了排除由于黑茶水提物对HepG2细胞的增殖作用而引起的报告基因诱导表达率增高的可能性，同样采用CCK8法，结果表明黑茶水提取物对细胞增殖均无明显影响。筛选的8种黑茶水提取物在上调LDLR方面均有效果，且8种黑茶水提物的作用与辛伐他汀相近，但其作用物质基础尚未确定，有待进一步研究。

实验发现8种黑茶品类中的金花天成茶（散茯茶）与茯砖茶对LDLR模型的激活值较高，这可能与这两类黑茶中所独有的“金花”菌有关，而有关“金花”菌的化学成分及其药理作用的研究报道较少，目前已有研究表明冠突散囊菌具有产生洛伐他汀的能力[17]，对非酒精性脂肪肝细胞有降脂效果[18]。

[1]Kamal DM, Ruixin, Joey, et al. Identi fi cation of a Novel cis-Acting Element Participating in Maximal Induction of the Human Low Density Lipoprotein Receptor Gene Transcription in Response to Low Cellular Cholesterol Levels [J]. Biol Chem,1996, 271(271)：33616-33622.

[2]Broussean ME, Kauffman RD, Herderick EE, et al. LCAT modulates atherogenic plasma lipoproteins and the extent of atherosclerosis only in the presence of normal LDL receptors in transgenic rabbits[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology, 2000,20(2)：450-458.

[3]赵丽萍, 邵宛芳. 普洱茶对高脂血症大鼠的降脂和预防脂肪肝作用[J]. 西南农业学报, 2010, 23(2)：579-583.

[4]肖文军, 任国谱, 傅冬和, 等. 茯茶辅助调节血脂作用研究[J].茶叶科学 , 2007, 27(3)：211-214.

[5]刘勤晋, 司辉清. 黑茶营养保健作用的研究[J]. 中国茶叶,1994(6)：36-37.

[6]宋鲁彬. 中国黑茶药理功能评价及活性物质研究[D]. 长沙：湖南农业大学, 2008.

[7]邓婷, 纪伟, 连霁虹, 等. 人apoA-Ⅰ基因启动子转录上调剂筛选系统的建立与应用 [J].天然产物研究与开发, 2007,19(5)：776-780.

[8]吴文亮. LDLR激动剂模型的建立及其在黑茶降脂作用研究中的应用[D]. 长沙：湖南农业大学, 2011.

[9]司书毅, 张月琴. 药物筛选--方法与实践[M]. 北京：化学工业出版社,2007.

[10]王少鹏, 李际仙, 彭志刚, 等. 高通量筛选瞬时受体势V3通道调节剂细胞模型的建立[J]. 生物工程学报, 2008,24(11)：1895-1901.

[11]刘晓辉, 洪斌, 王丽非, 等.人高密度脂蛋白受体表达上调剂筛选模型的建立[J]. 中国医学科学院学报, 2004,26(4)：354-358.

[12]傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 高通量筛选研究茯砖茶降脂减肥功效[J]. 茶叶科学, 2006, 26(3)： 209-214.

[13]傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 高通量筛选研究茯砖茶对FXR模型的作用[J]. 食品科学, 2007, 28(5)： 331-334.

[14]傅冬和, 刘仲华, 黄建安, 等. 茯砖茶中几种单体成分功效的高通量筛选研究 [J]. 茶叶科学, 2008, 28(1)：39-42.

[15]Rudenko G, Henry L, Henderson K, et al. Structure of the LDL receptor extracellular domain at endosomal pH[J]. Science,2002, 298(20)： 2353-2358.

[16]LL Rudel, JS Pakrs, FL Johnson, et al. Low density lipoproteins in atherosclerosis[J]. Lip Res, 1986, 27(5)： 465-474.

[17]郑欣欣. 茯砖茶中“金花”菌产孢机制及其功能性研究[D].西安：陕西科技大学, 2015.

[18]袁勇, 黄建安, 刘仲华, 等. 茯茶中“金花”孢子粉提取物对体外诱导的非酒精性脂肪肝细胞内甘油三酯代谢的影响[J]. 茶叶科学 , 2011, 31(2)：129-135.

Establishment of LDLR Agonist Model & Screening of Up—regulating LDLR Level Tea from the Different Varieties of Dark Tea

WU Wen-liang1,2，HUANG Jian-an1，LIU Zhong-hua1*，YANG Xin-he3，YUAN Yong4，
HUANG Hao2，YANG Wen-bo2

（1. Key Lab of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanical, Collaborative Innovation Center of Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Changsha 410128, China; 2. Tea Research Institute of Hunan Academy of Agricultural, Changsha 410125, China; 3. School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 4. Hunan Tea Group Co. , LTD, Changsha 410126, China）

In order to screen up—regulating LDLR level tea from the different varieties of dark tea, the LDLR agonist model was constructed. LDLR promoter(189bp) was cloned and ligated into the pGL3-basi vector contained luciferase reporter gene, then the recombinant reporter plasmid pGL3-LDLR was constructed. HepG2 cells were transfected with pGL3-LDLR and internal reference plasmid TK, we used the simvastatin lowering cholesterol as a positive control, and optimized various experimental conditions. The results showed that the simvastatin can induce the expression of luciferase reporter markedly and in a dependent manner, the Z′factor of this model was 0.72. The experiment results illustrated thismodel was sensitive and stable. And found that the various dark teas have a certain activity through the model, but the"Golden Flower" Tiancheng tea has the highest up—regulating activity to this model, activated values was 1.761.

Low density lipoprotein receptor, Dual-luciferase reporter gene, Drug screening, Dark tea

S571.1

A

1009-525X（2017）03-07-12, 16

2017-04-07

2017-08-18

梧州市科学研究与技术开发计划项目（201501028）、2015年梧州市六堡茶产业化项目、湖南省自然科学基金（2016JJ6058）

吴文亮（1984-），男，湖南茶陵人，在读博士研究生，研究方向：茶叶加工及茶叶功能成分化学。

*通讯作者：刘仲华（1965-），男，湖南衡阳人，教授，主要从事茶叶加工及功能成分化学研究。E-mail： lark-liu@163.com