党珍，张艳萍，王西芳*

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.安康市中医院，陕西 安康 725000)

·基础研究·

子洲黄芩中黄酮成分的含量测定及指纹图谱研究△

党珍1，张艳萍2，王西芳1*

(1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；2.安康市中医院，陕西 安康 725000)

目的：比较分析陕西子洲与其他产区黄芩中黄酮成分的含量并建立其HPLC指纹图谱，为子洲黄芩的质量评价及道地药材品牌建设提供资料。方法：采用HPLC测定样本中不同产区的黄芩所含黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素3个主要黄酮成分的含量。色谱条件：Eclipse-YDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液系统，梯度洗脱；体积流量为1.0 mL·min-1；检测波长为277 nm；柱温为30 ℃。结果：子洲黄芩中黄芩苷的平均质量分数为19.3%，明显高于样本包含的其他产地的黄芩；以黄芩苷峰为参照物峰，确定11个共有峰，建立了子洲黄芩HPLC指纹图谱共有模式方法。结论：陕西子洲黄芩有效成分含量高，品质优；建立的HPLC指纹图谱可以作为分析和控制子洲黄芩质量的基础资料。子洲作为黄芩道地药材产区发展潜力巨大。

子洲黄芩；HPLC指纹图谱；黄芩苷；品质质量

黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[1-2]。研究显示，黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素等黄酮类化合物为黄芩的主要有效成分[3-6]，具有解热抗炎、抗肿瘤、解毒、保肝及调节免疫等药理作用[7-9]。黄芩为我国传统常用中药，主产于陕西、甘肃、山西、河北、山东、河南等地；陕西子洲县位于陕西北部黄土高原丘陵沟壑区的腹地，是古代陕西黄芩的道地产区之一[2]，子洲黄芩有40余年的栽培历史，药材以其条长、质实、色黄的优良性状享誉省内外，现已成为该县中药材产业的主要经济支柱。有关子洲黄芩品质质量分析与研究，目前尚未见有报道，本文以黄芩中黄酮类为质量指标性成分，比较分析子洲与其他不同产区黄芩中黄酮成分的含量，建立HPLC指纹图谱，为子洲黄芩的品质质量评价及道地药材品牌建设提供基础资料。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260系列高效液相色谱仪及其工作站；GB204型十万分之一电子天平(梅特勒电子天平)；KQ-200KDE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；优普系列超纯水机UPT-Ⅱ(成都超纯水科技有限公司)。

1.2 试药

黄芩素对照品(批号：111595-201306)、黄芩苷对照品(批号：110715-201117)和汉黄芩素对照品(批号：111514-200403)，均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 黄芩药材

收集黄芩样品24批，经陕西中医药大学药学院生药教研室王西芳教授鉴定，均符合《中华人民共和国药典》2015版黄芩药材标准，样品来源的详细情况见表1。甲醇、乙醇、乙腈、甲酸、磷酸均为色谱纯，水为超纯水。其他试剂均为分析纯。

表1 黄芩样品来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Eclipse-YDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5m)；流动相为甲醇(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脱；程序：0～10 min，30%～40%A；10～20 min，40%～50%A；20～30min，50%～50%A；30～40 min，50%～60%A；40～50 min，60%～70%A；50～60 min，70%～30%A；检测波长：277 nm；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10L。

2.2 对照品溶液的制备

分别取黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品6.20、3.00、3.00 mg，精密称定，加入10 mL容量瓶内，甲醇超声使溶解，并用甲醇稀释至刻度，然后分别移取定容好的溶液5、2、1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别为 62、12、6 μg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。HPLC图见图1。

2.3 供试品溶液制备

取0.2 g黄芩药材粉末，精密称定，置 50 mL量瓶中，加70%乙醇水溶液40 mL超声提取40 min，放置至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45m微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。HPLC图见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品。图 1 混合对照溶液和黄芩供试溶液HPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取上述黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素混合对照品溶液，按2.1色谱条件分别进样3、5、10、15、20、25、30L测定峰面积值。以进样量为横坐标(X)，峰面积值为纵坐标(Y)，得黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素回归方程，分别为：Y=2 614.3X+14.318，r=1；Y=4 031.4X+4.746 8，r=1；Y=4 980.7X+4.927 9，r=0.999 8；黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素线性范围分别为：0.186～1.860g、0.036～0.360g、0.0186～0.186g。

2.4.3 稳定性试验 取S1号供试品溶液，按2.1方法分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积。在24 h内其RSD 值分别为1.5%、1.9%、1.8%，说明样品溶液在24 h 内稳定。

2.4.4 重复性试验 取S1号样品粉末6份，根据2.3方法制备供试品溶液，按2.1项下方法，测定黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积，RSD值分别为1.5%、1.5%、2.0%(n=6)，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知含量的S1号黄芩样品6份，每份0.1 g，精密称定，按2.3方法制备溶液，精密吸取2 mL于10 mL量瓶中，分别精密加入对照品溶液(黄芩苷730 g·mL-1、黄芩素48 g·mL-1、汉黄芩素12 g·mL-1)各1 mL，用甲醇定容。按2.1方法测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素加样回收试验结果(n=6)

2.4.6 样品含量测定 每个批次的药材样品按2.3方法平行制备3份，按2.1方法测定黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的峰面积，用外标法以峰面积计算样品中3个成分的含量，结果见表3。

表3 黄芩中3种黄酮类成分的含量测定结果

2.5 指纹图谱研究

2.5.1方法学考察

2.5.1.1 内参照峰的选择 按2.1色谱条件，分别注入黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品10L，测定，结果发现黄芩苷出峰时间适中、峰明显高，而且分离度比较好，故选择黄芩苷作为内参照峰。

2.5.1.2 精密度试验 按2.4.2所记录的色谱图上黄芩苷的色谱峰为内参照峰，比较各主要色谱峰的相对保留时间和峰面积在5%以上峰的相对峰面积，RSD分别在0.2%～1.45%和1.02%～1.80%，符合指纹图谱研究技术的要求。

2.5.1.3 重复性试验 按2.4.3所记录的色谱图上黄芩苷的色谱峰为内参照峰，比较各主要色谱峰的相对保留时间和峰面积在5%以上峰的相对峰面积，RSD值分别在0.1%～0.9%和0.75%～1.78%，该方法重复性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

2.5.1.4稳定性试验 按2.4.4所记录的色谱图上黄芩苷的色谱峰为内参照峰，比较各主要色谱峰的相对保留时间和峰面积在5%以上峰的相对峰面积，RSD值分别在0.1%～1.0%和0.83%～1.91%，表明该方法稳定性良好，符合指纹图谱研究技术的要求。

2.6 子洲黄芩指纹图谱的建立

将子洲的10个批次的黄芩样品，按2.3方法进行制备，按2.1条件测定并记录60 min色谱图，按照指纹图谱研究技术的要求，建立子洲产黄芩的指纹图谱。将黄芩苷的峰作为内参比峰，对各色谱峰的相对保留时间进行分析，从共有峰中选取稳定性好、峰面积大、特征明显的色谱峰作为特征峰。选取了其中11个色谱峰为特征峰，并计算各个共有峰相当于内参比峰的峰面积比值，通过和对照品的保留时间进行比较，并结合文献资料，指认了其中的6个峰，其中3为野黄芩苷、4为黄芩苷、7为汉黄芩苷、8为黄芩素、10为汉黄芩素、11为千层纸素，结果见图2、表4、表5，各样品的非共有峰面积与总峰面积的比值均小于10%，符合指纹图谱研究技术的要求。

2.7 相似度分析

运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版，进行相似度评价[10-11]。将实验数据导入该软件，

选定参照谱图，设定成中位数匹配模式，进行多点校正后自动匹配，然后软件会自动生成对照谱峰R，见图3，相似度计算结果见表6，相似度在0.994以上，相似度较高。

图2 子洲黄芩指纹图谱共有峰

峰号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10平均值RSD(%)10.3020.3030.3020.3010.3010.3030.3020.3030.3020.3000.3020.3320.5780.5750.5800.5800.5800.5810.5810.5820.5790.5750.5790.4230.6890.6860.6910.6910.7110.6910.6920.6920.6900.6860.6920.9741.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.0051.1391.1401.1401.1401.1401.1391.1371.1381.1431.1411.1400.1461.2491.2511.2541.2531.2521.2491.2451.2471.2561.2541.2510.2871.3051.2971.3011.3001.2991.2951.2901.2931.3031.3011.2980.3681.7241.7291.7281.7281.7271.7251.7231.7321.7361.7301.7280.2291.9751.9751.9711.9721.9721.9761.9741.9711.9861.9781.9750.23102.1052.1072.0992.0992.1012.1092.1062.1062.1162.1062.1050.24112.2182.2182.2092.2112.2122.2202.2172.2182.2292.2192.2170.25

表5 子洲黄芩指纹图谱共有峰相对峰面积

表6 黄芩药材相似度计算结果

注：R.对照指纹图谱。图3 10批子洲产黄芩药材的指纹图谱

3 结论与讨论

子洲黄芩的黄芩苷含量范围为：18.1%～20.8%，黄芩苷含量明显较高(《中华人民共和国药典》规定黄芩苷含量不得低于8%)；其中黄芩素、汉黄芩素的含量范围为：0.7%～1.7%，0.2%～0.4%，与其他产地样品比较没有明显差异。以黄芩苷含量为评价指标，子洲产黄芩的质量明显优于其他产地，子洲产黄芩具有很大的发展潜力。但单一成分并不能全面评价黄芩的品质，HPLC指纹图谱比较全面地反映了药材所含化学成分的数与量关系，可以更加有效地评价药材的内在质量。用子洲产10个批次的黄芩药材的HPLC色谱图建立了子洲产黄芩的指纹图谱共有模式，分析各指纹图谱发现存在一定差异，但均有相同的特征峰，而且分离效果都比较好，保留时间也相对稳定，该方法建立的指纹图谱可用于子洲产黄芩的质量评价，对子洲黄芩的品牌建设与产业发展有一定的指导意义。

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DeterminationofFlavonoidsandFingerprintsofScutellariabaicalensisfromZizhou

DANGZhen1，ZHANGYanping2，WANGXifang1*

(1.ShaanxiUniversityofChinesemedicine，Xianyang712046，China；2.AnkangHospitalofTraditionalChineseMedicine，Ankang725000，China)

Objective：To compare the contents of flavonoids inScutellariabaicalensisfrom Zizhou and other areas，and establish the HPLC fingerprint of ZizhouS.baicalensisaimed at providing references for the quality evaluation and pharmaceutical raw materials.Methods：Baicalin，baicalein and wogonin were determined by HPLC，and Eclipse-YDB-C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)were used with methanol(B)and 0.2% phosphoric acid solution(A)in gradient elution mode at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 277 nm and the column was 30 ℃.Results：The average content of baicalin in ZizhouS.baicalensiwas 19.3%，significantly higher than those of the other samples.11 common peaks were identified by using the baicalin peak as the reference，established the HPLC fingerprints of ZizhouS.baicalensitotal pattern method was establsied.Conclusion：ZizhouS.baicalensihas a high content of effective ingredients，good quality.HPLC fingerprint can be applied for analyzing and controlling the quality of ZizhouS.baicalensi.As the typicalScutellariaproducing region，Zizhou has a great potential for further development.

Scutellariabaicalensisfrom Zizhou；HPLC fingerprint；biaealin；quality

陕西省教育厅基金项目(Z54)

] 王西芳，教授，硕士生导师，研究方向：中药资源的开发利用；E-mail：wangxifang@vip.sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.008

2016-07-28)

*[