曹美娇，张婷婷，许枬，陈俏，陶鑫，曹佳

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

·基础研究·

NMR法分析鉴定神曲的发酵产物△

曹美娇，张婷婷，许枬*，陈俏，陶鑫，曹佳

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

目的：鉴定神曲中的主要化学成分，分析产地、工艺和原料对神曲主要成分的影响。方法：采用HMBC、1H-1H COSY、TOCOSY等多种核磁共振技术(NMR)鉴定神曲中主要成分，利用多元统计分析36批神曲的主要成分差异。结果：从神曲中鉴定出琥珀酸(1)、乳酸(2)、甘油酸(3)、甲氧基乙酸(4)、甲氧基乙酸铵(5)、脂肪酸(6)、甘油(7)、长链烯烃(8)、α-D-果糖(9)、α-D-葡萄糖(10)和β-D-葡萄糖(11)等成分，其中化合物1～9为从神曲中首次鉴定的成分。本研究还发现原料的成分几乎不以原形进入成品，而可能作为底物或调解微生物发酵环境的附加因子参与形成成品的成分，不同产地神曲的化学成分无显著区别。结论：神曲的化学成分主要由发酵过程形成的，产地、工艺和原料对其终产物成分种类影响较小，发酵过程是其主要影响因素。

神曲；化学成分；核磁共振技术；多元分析；发酵

神曲临床应用广泛，但主要成分不清楚，无法指导活性物质筛选，致使其质量控制标准与工艺规范化研究一直是重要难题，中华人民共和国药典也因此至今未收载该品[1-2]。神曲是由面粉等六种原料经固态发酵工艺制成的[3]。在复杂原料的基础上引入微生物的作用是其化学成分研究困难的主要原因[4-7]。固态发酵过程中微生物群落结构发生着有序的动态变化，化学成分随之发生着复杂的变化。固态发酵的产物研究需要以明确优势微生物或已知优势微生物的发酵特征为前提[9]。但到目前为止，神曲在这两个方面都不明确[8]。因此神曲主要成分研究需要特殊的手段。核磁共振技术(NMR)具有成分无歧视性、数据重现性好等优势，不仅可以识别复杂体系的化学成分类型，而且可以通过与文献对照来鉴定具有特征信号的成分，常用于复杂体系的成分分析与鉴定[10-11]。本文首次采用NMR技术鉴定出神曲的11种成分，并通过对比分析不同产地的36批神曲，发现生产工艺、产地对其主要成分种类影响不大，发酵过程可能是主要影响因素。

1 仪器与材料

BRUKER Avance 600型核磁共振谱仪(德国布鲁克公司)；超声波提取器(昆山市超声仪器有限公司，250 Hz)；Satorius电子天平(德国赛多利斯公司)。

氘代甲醇(国贸集团化学试剂有限公司)；自制神曲(照部颁标准由本实验室自行制备)；不同地区神曲(收集于四川、陕西、广西等地，不同地区收集样品7批)。

2 方法与结果

2.1 供试品的制备

取赤小豆0.7 g、苦杏仁0.7 g、面粉10 g、辣蓼、青蒿和苍耳草各0.4 g，精密称定，分别加甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液20 mL，蒸干，残渣加氘代甲醇0.5 mL使溶解，作为神曲各原料成分分析的供试品I-1～I-6。

取神曲样品各10 g，精密称定，分别加入甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液20 mL，蒸干，残渣加氘代甲醇0.5 mL使溶解，作为神曲成品成分分析的供试品I-7。

取神曲样品各10 g，精密称定，分别加入三氯甲烷25 mL，超声处理30 min，滤过，取续滤液20 mL，蒸干，残渣加氘代三氯甲烷0.5 mL使溶解，作为神曲成分分析的供试品II-1～II-7。

2.2 测试条件

供试品在配置BBO探头的Bruker AV 600 MHz型超导傅立叶变换核磁共振波谱仪上进行分析，在298.2 K的温度下，采用30度单脉冲程序zg30(Avance version：07/04/03)采集图谱。采样时间：5.453 s；谱宽：6 009.6 Hz；时域数据点数：64 K；累加次数：128次；弛豫时间：1 s。自由感应衰减信号经过傅立叶变换得到一维NMR图谱；内标物四甲基硅烷(TMS)的化学位移规定为δ。手动进行基线校正和相位校正。

2.3 谱图处理和数据分析

采用TOPSPIN 2.1采集原始图谱，经分段积分，去除溶剂氘代甲醇及水产生的共振信号区域δ3.30～3.30 及δ4.78～5.04的数值，并将所有数据标准化为相对于总峰面积的积分值，保存为数据文件。将数据导入SIMCA-p 11.5(Umetrics，Sweden)进行偏最小二乘法判别(PLS-DA)分析。

2.4 神曲主要成分鉴定

由神曲甲醇提取物的HSQC(见图1、3)中观察到δ5.17(d，J=3.7 Hz)质子，其碳信号为δ92.5。结合HMBC谱与TOCSY谱确认其与δ73.4、72.5、72.4、70.3、61.3等碳信号为同一化合物的信号(见图3)，该数据与文献中α-D-葡萄糖基本一致[12]，故鉴定神曲中含有α-D-葡萄糖；另有δ4.54(d，J=7.8 Hz)的质子，其在TOCOSY谱中与δ96.8、76.7、76.6、74.9、70.4、61.4的碳信号的质子在同一个偶合系统，该数据与文献中β-D-葡萄糖基本一致[12]，故鉴定神曲中含有β-D-葡萄糖。由δ98.1、70.1、69.8、68.1、64.4、62.9的碳信号在HSQC-TOCOSY谱中为同一个化合物的信号，且δ98.1的碳信号为季碳，其数据与文献中α-D-果糖基本一致[12]，故确定神曲中含有α-D-果糖。在1H-1H COSY谱观察δ4.21(q，J=6.8 Hz)，1.41(d，J=6.8 Hz)质子相互偶合，在HSQC谱中分别与δ67.1、19.6的碳信号相关，二者在HMBC谱中同与δ178.6的碳信号相关，确定提取物中含有乳酸，TOCSY谱证实上述推测[13]。另由HQSC谱确定δ3.33(s)及δ3.91(s)质子的碳信号分别为δ52.6和δ53.8，结合在HMBC谱中δ3.91(s)质子分别与δ52.6，65.9和167.6相关，δ3.33(s)分别与δ53.8，68.0，167.0相关，提示神曲中含有甲氧基乙酸和甲氧基乙酸铵[14]。由HSQC谱确定δ3.56(dd，J=6.1，11.3 Hz)，δ3.64(dd，J=4.9，11.3 Hz)质子的碳信号为δ63.0，δ3.72(m)质子的碳信为δ72.5，在1H-1H COSY谱中观察到两组质子相关，在HMBC谱中观察到δ3.56(dd，J=6.1，11.3 Hz)，δ3.64(dd，J=4.9，11.3 Hz)质子与δ72.5的碳信号相关，δ3.72(m)质子与δ63.0的碳信号相关，确定神曲中含有甘油[15]。HSQC-TOCSY谱证实上述推测。

由神曲三氯甲烷提取物的氢谱中δ2.30(m)的质子信号(见图3)在HMBC谱中与δ173.3的碳信号相关，提示神曲中含有丁二酸[16]。由氢谱(见图2)中观察到δ4.27(dd，J=11.9，4.3 Hz)，4.12(dd，J=11.9，6.0 Hz)与δ5.24(m)两组质子，质子数比为2∶1。由HSQC谱可知，二者的碳信号分别为δ62.2、69.2；在HMBC谱中观察到两组质子均与δ172.8的碳信号相关，其数据与文献中甘油酸基本一致，故鉴定该成分为甘油酸[17]。综合多种谱图推测，神曲中还含有具有HCOO-(CH2)n-CH3结构的脂肪酸及具有CH3-(CH2)n-CH2-CH=CH-CH2-(CH2)m-CH3结构的烯烃，从积分比例可知脂肪酸含量较高，长链烯含量略低。此外，由神曲甲醇提取物的氢谱中糖区(δ3.00～4.30)信号裂分复杂，对应的碳信号为碳谱中的sp3杂化连氧碳信号，提示神曲成分体系中可能还存在其他含量较大的多元醇类成分。综上结果，说明神曲主要成分为糖类、有机酸、脂肪酸和长链烯烃类成分。

表1 神曲中鉴定的化合物NMR数据

注：a.神曲氢谱；b.神曲碳谱。图1 神曲甲醇提取物的碳谱与氢谱

注：a.神曲氢谱；b.神曲碳谱。图2 神曲三氯甲烷提取物的氢谱和碳谱

经神曲的原料与成品中各成分信号的对比分析发现(见图4)，α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、甘油酸、甘油、乳酸在原料中未检出，而在成品中信号明显检出，由此确定这些成分是神曲发酵后产物，而甲氧基醋酸及甲氧基醋酸铵在青蒿、辣蓼和苍耳草中即可观察到，因此可知其主要来自青蒿、辣蓼等原料。

2.5 产地对六神曲成分的影响

从四川、辽宁、山东、北京、陕西等地区收集36批神曲，测定其1H-NMR谱图，结果见图5。为了分析各批次间主要成分差异，对实验所得的复杂数据通过降维处理后再进行多元统计分析。实验所用的偏最小二乘判别分析(PLS-DA)是有监督的分析方法，可以有效减少系统误差对实验结果的影响，外部模型验证法常用于模型有效性判定。由PLS-DA分析的得分矢量图(见图6)可见，各组样品分布均比较分散，说明其主要成分无显著性差异，提示产地、原料比例对神曲主要成分种类影响较小。该模型的t[1]和t[2]对X变量解释达82.5%，(R2Y)：0.924的原始变量变异Q2(cum)为0.831，表明该模型稳定性很好。

注：a.1H-1H COSY谱；b.TOCOSY谱；c.HSQC谱；d.HMBC谱。图3 神曲甲醇提取物的多种NMR谱

注：1.面粉；2.杏仁；3.赤小豆；4.辣蓼；5.苍耳草；6.青蒿；7.神曲；a.α-D-葡萄糖；b.β-D-葡萄糖；c.乳酸；d.甘油酸；e.甲氧基醋酸及甲氧基醋酸铵。图4 神曲与其原料的成分的NMR谱(放大谱)

注：1.北京；2.四川；3.广西；4.陕西；5.辽宁；6.安徽；7.上海。图5 不同产地六神曲1H-NMR谱图

注：1.四川；2.陕西；3.北京；4.山东；5.辽宁。图6 不同地区神曲1H-NMR谱图的PLS-DA得分矢量图(n=7)

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备及测试溶剂的选择

为减少混合物NMR谱图中各成分间的信号重叠干扰，准确鉴定神曲的成分，经预实验筛选，本实验确定依次用极性差异较大的甲醇和三氯甲烷作为提取溶剂，首次鉴定出神曲中含有甘油酸、乳酸、琥珀酸、甲氧基醋酸、甲氧基醋酸铵、α-D-果糖、脂肪酸和长链烯烃类等成分。这些成分与神曲发酵过程存在多种微生物基本吻合[4-5]。NMR分析的检测限一般在10-6μM以上，由此提示神曲中其他未检出的产物含量较低。

3.2 神曲发酵产物的产生途径分析

依据微生物代谢可知，甘油是酵母菌的代谢产物。在好氧条件下，酒酵母可以将葡萄糖和蔗糖发酵为甘油[17]。本研究发现，神曲中含有较大含量的甘油，提示神曲发酵过程中涉及酵母菌。这与神曲中鉴定出多种酵母菌[7]及本次研究发现神曲中含有大量的葡萄糖和果糖相吻合。乳酸是乳酸菌的糖酵解途径(EMP)或戊糖磷酸途径(HMP)主产物。在EMP途径，1 mol葡萄糖可转化为2 mol的乳酸。但一般情况下产率只有80%。在HMP途径，1 mol葡萄糖可转化为1 mol乳酸、1 molCO2和1 mol乙醇。甘油酸是丝氨酸降解的中间产物，具有促进醇类成分代谢等生物学功能。磷酸化后生成甘油酸3-磷酸，其有促进糖酵解作用。α-D-葡萄糖、β-D-葡萄糖、α-D-果糖是低聚糖、多糖(包括淀粉和纤维素)的基本单元。丁二酸(琥珀酸)是三羧酸循环的重要标志物。脂肪酸和长链烯类成分主要为微生物代谢产物[18]。综上可见，神曲发酵的优势菌种可能包括曲霉、酵母菌和乳酸菌，其主要涉及三条代谢途径：三羧酸循环、糖酵解和微生物自身代谢。糖、脂类的水解产物及三羧酸循环特征物质(琥珀酸)是神曲的主要成分，因此，糖的水解程度和琥珀酸含量变化可作为神曲发酵程度的考察指标。

3.3 产地对神曲成分种类的影响

不同地区神曲生产工艺不同，其组方也有一定差异。北方地区生产神曲时往往不加麦麸，而南方地区神曲的麦麸用量较大，原料比例也不同。为深入揭示不同产地神曲成分的差异性，本文采用无监督的PLS-DA多元统计法，对从国内六个省市收集36个样品进行分析。从结果看，产地、工艺、处方组成对神曲成分影响均很小，发酵过程是影响神曲成分种类的主要因素。由此提示，不同地区神曲可以采用统一的质控标准。由于同一产地神曲的核磁共振氢谱相似度很高，无明显差别，故比较不同产地神曲时只选择代表性样品。

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IdentificationofChemicalComponentinSHENQUBasedonNMRAnalysis

CAOMeijiao，ZHANGTingting，XUNan*，CHENQiao1，TAOXin，CAOJia

(SchoolofPharmacy，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian，116600,China)

Objective：To identify compounds and analyze the effect of producing area，procedure and ingredient on the components of SHEN QU.Method：1H-NMR，13C-NMR，HMBC，1H-1H COSY and TOCOSY were employed to identify the compounds from SHEN QU，multivariate analysis was applied to find the difference among 36 batch SHEN QU got from different county.Result：In this study，succinic acid(1)，lactic acid(2)，glyceric acid(3)，methoxyacetic acid(4)，methoxy acetic acid ammonium(5)，fatty acid(6)，glycerin(7)，long chain olefins(8)，α-D-fructose(9)，α-D-glucose(10)andβ-D-glucose(11)were elucidated in SHEN QU on the basis of NMR technology，compounds 1-9 were identified for the first time in it.1H-NMR analysis showed that the chemical component in stock material almost not be detected in end product of SHEN QU，while many new signals of saccharides，fatty acids and long chain alkenes were detected.The result of PLS-DA analysis of 36 batch sample indicated that chemical components of SHEN QU from different region are similar.Conclusion：The fermentation process of SHEN QU is more important factor affecting the chemical components than procedure，producing region and ingredients.

SHEN QU；chemical component；NMR；multivariate analysis；fermentation

国家公益性行业专项项目(201507004-03)

] 许枬，教授，药学博士，研究方向：中药有效成分及其质量研究；Tel：(0411)85890191；E-mail：xudanbs@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.004

2016-06-23)

*[