姜保平，乐亮，姚霞，许利嘉，肖伟，肖培根*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193；2.中国中药公司,北京 100195)

·基础研究·

HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立及在筛选两色金鸡菊活性化合物中的应用△

姜保平1，乐亮1，姚霞2，许利嘉1，肖伟1，肖培根1*

(1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/国家教育部中草药物质基础与资源利用重点实验室，北京 100193；2.中国中药公司,北京 100195)

目的：体外建立人肝癌细胞(HepG2)胰岛素抵抗模型，并初步筛选两色金鸡菊中可有效改善胰岛素抵抗的萃取部位及活性化合物。方法：用不同浓度的胰岛素、棕榈酸或葡萄糖分别对HepG2细胞进行不同时间的诱导，通过MTT法对细胞活性进行评价及葡萄糖氧化酶法对HepG2细胞葡萄糖消耗量测定，明确建立稳定的HepG2胰岛素抵抗模型的试剂诱导浓度及诱导时间。模型建立后，应用不同浓度的两色金鸡菊粗提物、各萃取部位及七个单体化合物奥卡宁(Okanin，2)、3′，4′，8-三羟基黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(3′，4′，8-trihydroxyflavone-7-O-β-D-glucopyranoside，3)、槲皮素(Quercetin，4)、黄诺马苷(Flavanomarein，5)、马里苷(Marein，6)、豆甾醇(Stigmasterol，13)、紫铆花素(Butein，16)预处理细胞24 h，再用55 mmol·L-1葡萄糖刺激24h，用葡萄糖氧化酶法或2-NBDG荧光标记葡萄糖法分别观察不同浓度的上述成分对胰岛素抵抗模型HepG2细胞糖消耗或糖吸收的影响。MTT法对各组细胞活性进行评价。结果：HepG2细胞在10-7mol·L-1浓度的胰岛素中作用24 h，或在55 mmol·L-1的葡萄糖中刺激24 h，细胞葡萄糖消耗量明显减少(P<0.01)且稳定性良好，并且对细胞存活率未造成影响，可作为胰岛素抵抗模型；而棕榈酸组虽然糖消耗显著下降但细胞存活率也显著降低。两色金鸡菊总提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位及2号、3号、5号和16号化合物均有改善细胞胰岛素抵抗作用，其中5号黄诺马苷和6号马里苷效果较好。结论：黄诺马苷和马里苷可能是两色金鸡菊中改善胰岛素抵抗的主要活性成分。

两色金鸡菊；胰岛素抵抗；HepG2细胞

两色金鸡菊CoreopsistinctoriaNutt.又名雪菊、金鸡菊，系菊科(Asteraceae)金鸡菊属(Coreopsis)的干燥头状花序。载于《新华本草纲要》，味甘，性平，具有清热解毒，化湿止痢。两色金鸡菊原产于北美，我国引种成功后，在新疆有大规模种植，俗称雪菊，在当地被当作花茶饮用，维吾尔民间用来预防心血管疾病[1]。两色金鸡菊在中国的药用历史并不长，然而在葡萄牙有每天喝两杯热两色金鸡菊茶饮用于控制糖尿病的传统[2]。已有的研究表明，两色金鸡菊的化学成分主要包括黄酮类、糖类、甾类、香豆素、有机酸、鞣质、挥发油等等[3-5]；Dias等报道两色金鸡菊显著降低链脲酶素引起的血糖升高[6]，另有研究表明两色金鸡菊还具有抗氧化、降血压、降血脂等药理活性，有潜在的药用价值[7-10]。本课题组前期研究发现，两色金鸡菊茶饮能显著降低大鼠血糖，改善胰岛素抵抗，且明显改善高糖高脂饮食引起的大鼠相关代谢通路的紊乱[7]。而对两色金鸡菊改善胰岛素抵抗的活性部位及活性成分并未报道。本实验在前期基础上建立HepG2细胞IR模型，对两色金鸡菊的各萃取部位和部分单体化合物促进胰岛素抵抗细胞糖吸收的活性进行筛选，为两色金鸡菊活性物质基础的研究提供参考。

1 仪器、材料

1.1 仪器

Tecan荧光酶标仪(奥地利Infinite 1000 M)；BIO-tekELx800酶标仪(美国Biotek公司)；CO2培养箱(Thermo Forma 公司)；超净工作台(日本AIR TECH 公司)；低温离心机(德国Eppendorf)；Nikon倒置显微镜与照相系统(日本)；高压灭菌锅(美国Thermo Foroma)；DJ-300S分析天平(日本SHINKO公司)；电热恒温水浴箱(北京长安科学仪器厂)；HZQ-C振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)。

1.2 材料

HepG2细胞购自北京协和医学院细胞库；人胰岛素(批号：I3536)、二甲基亚砜、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma公司；DMEM低糖培养基、DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；无酚红DMEM培养基(批号：11054-001)、胰酶(Trpsin)、胎牛血清(批号：10099-141)均购自美国Gibco；四甲基偶氮噻唑盐(MTT)购自美国Amresco公司；葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法(GOD，批号：E1010)购自普利莱基因技术有限公司；2-NBDG(批号：N13195)购自美国Life technologies。细胞培养板各种规格均购自美国Costar公司。4%多聚甲醛购自北京华越洋生物，无水乙醇购自北京化工厂。实验所配试剂用水均为双蒸水。

2 方法

2.1 高浓度的胰岛素(Insulin)、棕榈酸(Palmitic)或葡萄糖(Glucose)对细胞增殖的影响

将细胞以 10000 个/孔接种于96孔培养板中。分为空白组和模型组(Model)。待细胞单层贴壁后，空白组加入正常培养液，模型组加入新配置的含有胰岛素、棕榈酸或葡萄糖各浓度(Concentratrion)的培养液。MTT 法分别检测6、12、24、48 h时细胞的生长情况。

2.2 HepG2细胞胰岛素抵抗模型的建立

按文献方法稍作改进。将处于对数生长期的细胞消化后，用含10% FBS的低糖DMEM培养基调整细胞密度为1×105个·mL-1，转入96孔板中。培养24 h后，弃去旧培养基加入新配制的含2% FBS的DMEM低糖培养基，继续培养12 h。将细胞随机分为对照组(control)、棕榈酸组(PA)、高糖组(HG)和高胰岛素组(Insulin)，弃去培养基对照组(control)换以含2% FBS的DMEM低糖培养基，软脂酸组(PA)换以含250、500、1000 μmol·L-1的PA并含2%FBS的DMEM低糖培养基，培养12 h和24 h；高糖组换以含25、33、 44、55、66 mmol·L-1的葡萄糖并含2% FBS的DMEM低糖培养基，培养6、12、24 h；高胰岛素组换以含1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7、1×10-6mol·L-1的含2% FBS的DMEM低糖培养基，培养12、24、48 h。弃去培养基，先用PBS洗涤3次后，每孔含1×10-7mol·L-1胰岛素的无酚红培养基于37 ℃刺激20 min后，用葡萄糖测定试剂盒检测培养基的葡萄糖含量。于酶标仪550或570 nm处测其吸光度(A)值。以不铺细胞的空白孔为空白对照，计算胰岛素刺激20 min过程中各组细胞的葡萄糖消耗量(Glucose consumption)。采用此方法通过优化浓度和作用时间建立适宜的高浓度胰岛素诱发的HepG2细胞IR模型。所有被试药物均用DMSO溶解，DMSO的终浓度不超过0.5%。

2.3 MTT法检测各模型组细胞存活率(Cell survival)

细胞培养及药物分组同2.2，在不同浓度的PA，胰岛素或高糖处理相应的时间后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，继续孵育4 h，弃去上清，吸干残留液，每孔加入DMSO 150 μL，摇床上振摇10 min至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解，置于酶标仪570 nm处测其吸光度值。

2.4 两色金鸡菊各萃取部位对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗的影响

实验分为空白组、对照组、IR 模型组、两色金鸡菊各部位组(石油醚PE、乙酸乙酯ETAC、正丁醇NBA和水W)。按照2.2方法制备 IR 模型。各组均分为加胰岛素和不加胰岛素组。每组设六个复孔。加药物24 h后以葡萄糖氧化酶法检测培养液上清液中的葡萄糖含量。以未接种细胞的空白组的葡萄糖含量均值减去测得的培养液中葡萄糖含量即得各孔细胞的葡萄糖消耗量。

2.5 两色金鸡菊各萃取部位对细胞增殖的影响

实验分为空白组、模型组和给药组。待细胞单层贴壁后，空白组和模型组加入无血清的培养液，加入新配制的含有不同浓度的两色金鸡菊各萃取部位的培养液刺激24 h，模型组和给药组换成高浓度葡糖糖刺激24h，对照组换成无血清的培养基MTT 法分别检测细胞的生长情况。

2.6 两色金鸡菊单体对IR-HepG2细胞糖吸收的影响

实验分为空白组、对照组、IR 模型组、两色金鸡菊各单体组(浓度为100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)。除了空白组、对照组，其他各组先用不通过浓度化合物预处理细胞24 h，再用55 mmol·L-1葡萄糖刺激细胞24 h，最后用含1×10-7mol·L-1胰岛素刺激细胞20 min，每组设六个复孔。胰岛素刺激细胞20 min后用葡萄糖氧化酶法检测培养液上清液中的葡萄糖含量。以未接种细胞的空白组的葡萄糖含量均值减去测得的培养液中葡萄糖含量即得各孔细胞的葡萄糖消耗量。

2.7 两色金鸡菊单体对细胞增殖的影响

待细胞单层贴壁后，空白组加入正常培养液，给药组加入新配制的含有不同浓度(100、50、25、12.5、6.25 μmol·L-1)的两色金鸡菊单体的培养液。MTT法分别检测细胞的生长情况。

2.8 统计分析

采用 SPSS 17.0软件进行统计分析。两组间计量资料比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度胰岛素与HepG2细胞作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

如图1A显示，在不同浓度(1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7、1×10-6mol·L-1)胰岛素刺激12 h，与空白组比较，胰岛素组葡萄糖消耗量有一定的升高，但并无统计学差异；1B所示，在不同浓度的胰岛素刺激24 h后，与空白组比较，1×10-9、5×10-8、5×10-7、1×10-6mol·L-1组葡萄糖的消耗量显著下降；1C显示，在不同浓度的胰岛素刺激48 h后与空白组比较1×10-9、5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7mol·L-1组葡萄糖的消耗量显著减少；1D和1E在不同浓度的胰岛素刺激细胞24 h及48 h后细胞存活率与对照组比较均有显著变化。1F，在1×10-6mol·L-1的胰岛素作用细胞48 h后形态学观察，发现细胞状态良好。

3.2 不同浓度棕榈酸与HepG2细胞作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

如图2A显示，在0.25 mmol·L-1棕榈酸刺激细胞6 h，与空白组比较，细胞状态明显变差，表现为细胞体积缩小，连接消失，与周围的细胞脱离；而2B，在不同浓度(0.125、0.25、0.5 mmol·L-1)的棕榈酸刺激12 h后，与空白组比较0.125、0.25 mmol·L-1组葡萄糖的消耗量显著下降；2C，在不同浓度(0.062 5、0.125、0.25、0.5 mmol·L-1)的棕榈酸刺激24 h后与空白组比较0.25 mmol·L-1组葡萄糖的消耗量显著减少。MTT检测细胞存活率发现与棕榈酸作用12 h和24 h细胞存活率与对照组比较显著下降(图2D，2E)，且2F，在0.25 mmol·L-1的棕榈酸作用细胞24 h后形态学观察，发现细胞凋亡明显。

注：A.不同浓度胰岛素作用12 h对细胞糖消耗的影响；B.不同浓度胰岛素作用24 h对细胞糖消耗的影响；C.不同浓度胰岛素作用48 h对细胞糖消耗的影响；D.不同浓度胰岛素与HepG2细胞作用24 h对细胞存活率的影响；E.不同浓度胰岛素与HepG2细胞作用48 h对细胞存活率的影响；F.HepG2细胞与1×10-6 mol·L-1的胰岛素作用48 h形态学观察(20×)；n=6，与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图1 不同浓度胰岛素作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

注：A.0.25 mmol·L-1的棕榈酸与细胞作用6 h的形态学观察；B.不同浓度棕榈酸作用12 h对细胞糖消耗的变化；C.不同浓度棕榈酸作用24 h对细胞糖消耗的变化为不同浓度棕榈酸作用12或24 h细胞糖消耗的变化；D.不同浓度的棕榈酸与HepG2细胞作用12 h对细胞存活率的影响；E.不同浓度的棕榈酸与HepG2细胞作用24 h对细胞存活率的影响；F.HepG2细胞与0.25 mmol·L-1的胰岛素作用24 h形态学观察；n=6，与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图2 不同浓度棕榈酸作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

3.3 不同浓度葡萄糖与HepG2细胞作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

如图3A显示，不同浓度的葡萄糖刺激细胞6 h后，与空白组比较，33、55、66 mmol·L-1组细胞糖消耗显著下降；而3B显示，在不同浓度的葡萄糖刺激12 h后，与空白组比较，25、44、55、66 mmol·L-1组葡萄糖的消耗量显著下降；如图3C所示，在不同浓度的葡萄糖刺激24 h后与空白组比较25、33、44、55、66 mmol·L-1组葡萄糖的消耗量均显著减少；而3D和3E表明，经MTT法检测细胞存活率发现，不同浓度葡萄糖作用6 h和12 h细胞存活率与对照组比较均无显著变化，55 mmol·L-1的葡萄糖作用细胞24 h后形态学观察，细胞生存状态良好。

注：A.不同浓度葡萄糖作用6 h对细胞糖消耗的变化；B.不同浓度葡萄糖作用12 h对细胞糖消耗的变化；C.不同浓度葡萄糖作用24 h对细胞糖消耗的变化；D.HepG2细胞与不同浓度的葡萄糖作用6 h对细胞存活率的影响；E：HepG2细胞与不同浓度的葡萄糖作用12 h对细胞存活率的影响；F.不同浓度的棕榈酸与HepG2细胞作用24 h形态学观察；n=6，与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。图3 不同浓度葡萄糖作用不同时间对HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

3.4 两色金鸡菊各萃取部位对IR-HepG2细胞葡萄糖消耗及细胞存活率的影响

如图4A显示，在不同浓度的两色金鸡菊各萃取部位刺激细胞24 h，与空白组比较，石油醚部分(PET)各浓度组糖消耗量与模型组(55 mmol·L-1葡萄糖)比较无明显改善；乙酸乙酯部分(EtOAc)各组细胞糖消耗与模型组比较显著升高；正丁醇部分(nBuOH)四个浓度组与模型组比较均能显著增加糖消耗；水部分(Water)仅12.5 μg·mL-1浓度组与模型组比较能显著增加糖消耗；而两色金鸡菊总提物部分(Total)在50、25、12.5 μg·mL-1浓度组的糖消耗与模型组比较均显著升高。图4B显示，用MTT检测细胞存活率结果发现，两色金鸡菊各部分处理细胞24 h，细胞存活率与对照组比较，除PET 50和25 μg·mL-1两组细胞存活率显著下降外，其他组均无显著变化。

3.5 两色金鸡菊7种单体对IR-HepG2细胞葡萄糖吸收的影响

为了检测两色金鸡菊中哪些单体化合物对IR-HepG2细胞糖吸收具有改善作用，从而找到两色金鸡菊中的活性化合物。我们对两色金鸡菊中7种单体化合物(图5)进行了促进IR-HepG2细胞糖吸收的活性筛选。

注：A.为不同浓度的两色金鸡菊各部位与细胞作用24 h对葡萄糖消耗的影响；B.HepG2细胞与不同浓度的两色金鸡菊各部位作用24 h对细胞存活率的影响；n=6，与对照组比较，*P <0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图4 不同浓度两色金鸡菊各部位对IR-HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

图5 7种化合物的结构式

用不同浓度的化合物预处理细胞24 h后，用55 mmol·L-1的葡萄糖刺激细胞24 h，然后用含1×10-7mol·L-1胰岛素的无酚红培养基37 ℃孵育孵育细胞20 min，，酶标仪检测吸光度值，用方法中提到的公式计算葡萄糖消耗量。如图6A所示，与对照组比较，经高糖刺激后，模型组对胰岛素的敏感性显著降低，细胞的糖消耗量显著下降(P<0.05)，说明模型组细胞对胰岛素产生抵抗。与模型组比较，四种化合物在低浓度1.56 μmol·L-1均能显著改善HepG2细胞的胰岛素敏感性，促进糖消耗，相比之下5号化合物效果最好，且有效范围最广，在1.562 5、12.5、25和50 μmol·L-1均能显著改善IR-HepG2细胞的胰岛素敏感性，促进糖吸收。如图6B所示，四种化物对细胞存活率的测定结果显示，3号化合物在各剂量浓度下均能显著增加细胞存活率，表明3号化合物有一定的促进细胞增殖的作用；其它三种化合物对细胞存活率则无显著影响。

注：A.为两色金鸡菊中不同浓度的13号、5号和4号化合物分别与细胞作用24 h对葡萄糖消耗的影响；B.MTT法检测细胞存活率；n=5，与对照组比较，*P <0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图6 两色金鸡菊部分化合物对IR-HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

如图7A所示，与对照组比较，经高糖刺激后，模型组细胞对胰岛素的敏感性显著降低，细胞的糖消耗量显著下降(P<0.05)，说明模型组细胞对胰岛素产生了抵抗。化合物预处理组与模型组比较，三种化合物的有效浓度集中于6.25～50 μmol·L-1。且相比之下，三种化合物中6号的活性显著优于其它两种化合物。如图7B，四种化物对细胞存活率的影响结果显示，16号化合物在6.25～100 μmol·L-1均能显著降低细胞存活率，有一定的细胞毒作用；其它两种化合物对细胞存活率则无显著影响。

注：A.为两色金鸡菊中不同浓度的6号、16号和2号化合物分别与细胞作用24 h对葡萄糖消耗的影响。B.MTT法检测细胞存活率；n=5，与对照组比较，*P <0.05；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。图7 两色金鸡菊部分化合物对IR-HepG2细胞糖消耗及存活率的影响

4 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病等代谢综合症的共同发病基础[11]，因此，改善胰岛素抵抗已成为治疗2型糖尿病的主要途径。胰岛素抵抗在细胞水平的定义为：由于细胞表面胰岛素受体数目减少或受体后缺陷，导致一定浓度的胰岛素不能使细胞达到预期的代谢水平。肝脏是胰岛素作用的重要靶器官，也是产生胰岛素抵抗的主要部位之一。在关于胰岛素抵抗细胞模型的文献报道中，应用人源肝癌细胞——HepG2细胞株作为诱导模型的居多，因其表面表达的高亲和力胰岛素受体满足典型胰岛素受体所要求的标准[12-13]。研究者将HepG2与高浓度胰岛素(5×10-7mol·L-1)共同孵育后，有胰岛素受体和受体后的功能缺陷，受体自身磷酸化功能和胰岛素刺激的糖、脂、蛋白质代谢功能降低[14]，因而HepG2是研究肝IR的理想细胞模型。本实验结果表明，不同浓度的胰岛素诱导HepG2细胞IR时，以1×10-7和5×10-7mol·L-1诱导模型效果较佳，而1×10-7mol·L-1稳定性最好，且细胞活力良好。而棕榈酸诱导的模型以0.25 mmol·L-1作用12 h和24 h效果最佳，但棕榈酸与细胞作用6 h即可导致细胞活力下降，死亡增多。高糖诱导的模型中以12 h中44、55和66 mmol·L-1效果较好，24 h中 33～66 mmol·L-1效果均较好，且66 mmol·L-1作用细胞24 h并未引起细胞毒性，从模型稳定性考虑，55 mmol·L-1葡萄糖作用细胞24 h为佳。因此，综合以上情况，确定胰岛素抵抗HepG2细胞模型的最佳方案为：1×10-7mol·L-1胰岛素或55 mmol·L-1葡萄糖作用细胞24 h。

利用所建立的细胞模型(55 mmol·L-1葡萄糖，24 h)对两色金鸡菊茶饮各萃取部位进行筛选。结果发现，乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位和总提物效果为佳，且无细胞毒性。

利用所建立的细胞模型(55 mmol·L-1葡萄糖，24 h)对两色金鸡菊部分化合物进行筛选。结果发现，5号化合物falavanomarein(黄诺马苷)和6号化合物marein(马里苷)具有较好的活性，且两种化合物在两色金鸡菊中含量较高，推测它们为两色金鸡菊改善胰岛素抵抗的主要活性化合物。

本研究结果进一步证实两色金鸡菊改善胰岛素抵抗的作用，说明其具有一定的药用价值；另外我们筛选出其主要活性化合物，为两色金鸡菊的进一步研究开发提供参考。

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EstablishmentofInsulinResistanceHepG2CellModelandItsApplicationinScreeningBioactiveComponentsofCoreopsistinctoria

JIANGBaoping1，LELiang1，YAOXia2，XULijia1，XIAOWei1，XIAOPeigen1*

(1.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China； 2.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China)

Objective：To establish human hepatoma carcinoma cell(HepG2 cell)model of insulin resistance in vitro and to initially select the effective ingredients ofCoreopsistinctoria.Methods：HepG2 cells were induced by insulin，palmic acidor glucose of different concentrations for different time.Through the estimation of the cell activity with MTT method and glucose consumption with glucose oxidase method，the effective concentrations and time of inducer in the insulin resistance cell model were ascertained.After the cell model establishment，HepG2 cells were pretreated with crude extracts ofC.tinctoria，different fractions or compounds of different concentrations for 24 h，and the influences on the model cells regarding glucose consumption were observed through the glucose oxidase method or fluorescent glucose 2-NBDG and the cell viability was evaluated by the MTT method.Results：Compared with the control group，1×10-7mol·L-1insulin-stimulated cells 24 h or 55 mmol·L-1glucose-stimulated cells 24 h has a significant insulin resistance effect，and high concentrations of insulin or glucose did not affect the cell viability，while palmitic acid group emerges insulin resistant but the cell viability was also significantly decreased.Screening results showed that the 5th compound falavanomarein and the 6th compounds marein had better preventive activity of high glucose-induced insulin resistance.Conclusion：Insulin resistance cell models are successfully made.Falavanomarein and marein could be the main active compounds ofC.tinctoria.

Coreopsistinctoria；insulin resistance；HepG2 cell

国家自然科学基金资助项目(81274188)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程经费资助(81573576)

] 肖培根，中国工程院院士，研究方向：药用植物资源学；Tel：(010)62894462，E-mail：pgxiao@implad.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.2.002

2016-04-12)

*[