曲守方 于婷 孙楠 李丽莉 陈芳 吴英松 黄杰★

•述 评•

染色体非整倍体无创产前检测技术质控要点及临床应用进展

曲守方1于婷1孙楠1李丽莉1陈芳2吴英松3黄杰1★

基于下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术的染色体非整倍体无创产前检测技术是产前诊断领域的重要突破，其检测原理简单、技术灵敏度和准确性很高，已成为目前非整倍体产前筛查发展及推广的主要方向。但由于NGS技术检测流程复杂，影响因素较多，需要在样本采集、运输、核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析各个关键节点进行质控。同时，由于其试剂成分复杂、技术难度大、社会关注度高，也需对注册产品指标进行明确。鉴于此，本文对染色体非整倍体无创产前检测技术质控要点、产品规范要求及临床应用状况进行简要评述。

染色体非整倍体无创产前检测；下一代测序；质控要点；产品规范

染色体非整倍体是指相对于人正常的46条染色体而言，细胞中的某一条或几条染色体数目增加或减少，与婴幼儿期显著的发病率和死亡率有着密切的关系。新生儿中染色体异常的发病率为1/160，其中 21⁃三体综合征（trisomy 21，T21）、18⁃三体综合征（trisomy 18，T18）和 13⁃三体综合征（trisomy 13，T13）是3种最主要常染色体非整倍体疾病，在新生儿中发病率分别为1/800～1/600、1/7 000～1/3 500 和 1/6 000～1/5 000［1］。针对染色体疾病的产前检测主要以血清学筛查、羊水穿刺为主。但血清学筛查准确度较低，具有5%的假阳性率及20%～40%的漏诊率；羊水穿刺虽然准确度较高，但是对孕妇具有创伤性，有1%的流产风险，不便于大规模的产前检测［2⁃3］。1997 年，Lo 等人［4］在孕妇血浆和血清中发现了胎儿游离DNA片段，这为遗传病的无创性产前基因检测提供了理论基础。2008年，首次通过下一代测序（next gen⁃eration sequencing，NGS）技术利用母亲血浆游离DNA（cell⁃free DNA，cfDNA）进行无创染色体非整倍体（non⁃invasive prenatal testing，NIPT）检测［5⁃6］，随后大样本研究表明该技术非常有效［7］。由于基于NGS技术的NIPT具有无创取样、无流产风险、高灵敏度、高准确性（≥99%）等特点，成为目前染色体非整倍体产前筛查与诊断技术的主要手段。美国妇产科医师协会（the American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）、美国医学遗传学会（the American College of Medical Ge⁃netics and Genomics，ACMG）、国际产前诊断学会（the International Society for Prenatal Diagnosis，ISPD）等多个联盟组织正在极力推进这项技术的临床应用［8⁃10］。2016 年 7月28日 ACMG发表最新声明：NIPT是目前染色体非整倍体最敏感的检测技术手段，没有之一，并且能够在不同年龄人群中替代传统的三体综合征筛查技术［11］。但由于NGS技术检测流程复杂，影响因素较多，需要在整个实验流程进行严格质控。同时，由于其试剂成分复杂、技术难度大、社会关注度高，也需明确其产品规范要求。因此，本文对NIPT的基本原理、质控要点、产品规范要求进行简要阐述并对其在国内的发展历程、适应症的拓展及临床应用现状进行简要评述，期望有助于促进NIPT技术和市场的规范、健康、快速、有序发展。

作者单位：1.中国食品药品检定研究院，北京100050
2.深圳国家基因库，广东，深圳518083
3.南方医科大学检验与生物技术学院，广东，广州510515

1 基本原理

1997年，Lo等人［4］研究证实在孕妇的血浆中存在有胎儿游离DNA片段，为无创DNA产前检测技术提供了依据。通过高通量测序技术可以对这些胎儿游离DNA进行检测，利用生物信息学分析软件系统对检测结果进行分析，最终得出胎儿患有21⁃三体综合征、18⁃三体综合征和13⁃三体综合征的风险率。首先在孕妇血浆中的游离DNA片段两端加上通用的测序接头，构建好可以用于测序的测序文库。利用高通量测序仪对构建好的测序模板进行测序，最终获得每个DNA片段的碱基序列。利用生物信息学分析软件系统把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，计算出样本的游离DNA序列被分配到每条染色体上的具体数值比例，当胎儿的某条染色体数目发生异常时，其对应的游离DNA序列数量会小幅增加，通过高通量测序技术和生物信息学数据分析可以检测出这种微量变化，从而获得染色体数目的信息，进而实现对21⁃三体综合征、18⁃三体综合征和13⁃三体综合征进行快速的产前辅助诊断。

2 质控要点

2.1 样品采集、运输

2.1.1 样品采集

NIPT检测样品为孕妇外周血血浆。一般采集5 mL外周静脉全血并分离血浆。使用的采血管可根据实际情况选择EDTA抗凝管或者Streck Cell⁃Free DNA BCT管。其中EDTA抗凝采血管采集后4℃保存，8 h内进行血浆分离。Streck Cell⁃Free DNA BCT采血管具有保护游离DNA不降解及细胞不破碎的作用，可常温保存（18～25℃），72 h内进行血浆分离。两步离心法分离血浆，1 600 r/min 4℃离心10min，吸取上清血浆，16 000 r/min 4℃离心10min，吸取上清血浆，立即进行游离DNA的提取或者立即放入-20℃或-80℃冰箱中保存。

2.1.2 保存与运输

全血样本：EDTA抗凝管的外周血在4℃条件下运输，须在8 h内送达并及时分离血浆；Streck Cell⁃Free DNA BCT 采血管外周血常温（18～25℃）运输，72 h内送达并及时分离血浆。血浆样本应在干冰条件下运输，到达后及时存放于-80℃冰箱中。

2.2 游离DNA提取

一般使用200～600μL血浆提取游离DNA，保证其片段多态性有足够的代表性。提取方法可以使用磁珠法，也可以使用离心柱法。但应在标本制备区进行并设立用于建库的DNA质量控制标准，如规定建库的DNA量并设立最低起始量等。一般要求浓度大于0.05 ng/μL，0.1～0.2 ng/μL为佳。

2.3 文库制备、质控

文库制备应当严格按照标准操作流程进行。多个样本pooling时一般使用barcode对样本进行区分，每个样本应建立一个或一组唯一的barcode。每个barcode只能用于一个标本，但当样本数量大于标签barcode数时，只要不在同一个检测run，标签barcode都是可以重复使用的。应建立文库检测浓度及文库片段分布范围的文库质量控制标准。一般要求文库DNA浓度＞0.1 ng/μL且文库长度在200～300 bp。

2.4 测序及数据分析

NIPT检测主要应用Z检验（Z test）。Z检验是一般用于大样本平均值差异性检验的方法。它是用标准正态分布的理论来推断差异发生的概率，从而比较2个平均数的差异是否显著。Z⁃值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布。

对孕妇血浆游离DNA进行全基因组测序，获取DNA片段的碱基序列；将碱基序列与人类参考基因组（hg19）进行比对得到碱基序列的确切位置；去除低质量、多匹配和非完全匹配的碱基序列；将每条染色体等分为50 kb的窗口，根据碱基序列的位置信息，计算分配到每个窗口的原始读段数，使用局部加权回归方法Loess对每个窗口的原始读段数进行校正，以消除测序导致的GC偏好性。采用唯一比对的序列进行后续统计，获得大样本样品的总有效数据（total mapped readsn）以及比对各个染色体有效数据（mapped to chromo⁃somenm）。为了消除不同样本的测序数据量差异对检测结果的影响，分别将各个染色体的有效数据除以总有效数据即获得有效数据百分比（unique reads ratio，UR），见计算公式（1）：

其中m为染色体编号，m∈（1...22，X，Y），n为大样本样品数。计算大样本样品的UR均值及方差，见计算公式（2）：

其中m为染色体编号，m∈（1...22，X，Y），n为大样本样品数。

计算每个样品各个染色体的Z值，见计算公式（3）：

其中m为染色体编号，m∈（1...22，X，Y），n为样品数。

根据统计学原理，出现在Z⁃值为正负3以外的数值，则有99.9%的可能为阳性，因此，通常将Z⁃值=3定为参考值分界点。|Z⁃值|＞3则判断为胎儿染色体非整倍体阳性。如果某个样品的染色体chr21的Z⁃值大于3，则认为该样品的chr21的UR显著（α＜0.005）离群，即chr21⁃三体。

2.5 阴阳性质控

为了控制实验流程的重复性或效率，保证检测有效性，需在检测流程中加入阴阳性质控品，并能够监控从样本DNA片段到最终测序结果全过程。阴性对照品、阳性对照品浓度可根据不同测序平台的需求确定。建议每个检测run或测序都要进行阴阳性质控品的检测。

3 产品规范要求

为规范胎儿染色体非整倍体检测试剂盒（高通量测序法）的产品设计开发、性能评价的诊断试剂技术指标和要求，并为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考，中国食品药品检定研究院制定了《基于孕妇游离DNA的胎儿染色体非整倍体检测试剂质量控制技术评价指南（高通量测序法）》［12］。主要从测序平台的适用性、文库构建和测序策略、数据量控制、阴阳性符合率、嵌合和微缺失微重复检出率、检测限和重复性等方面提出了具体的产品规范要求。

国内下一代测序平台主要分为以Illumina公司、华大基因公司为代表光学技术和以Thermo公司为代表半导体技术。不同测序平台仪器大小、通量、读长、运行时间及测序成本等特异性参数不同，应结合具体的临床应用需求选择合适的测序平台并进行评估。不同的测序平台要求的测序检测方法和文库构建方法也有所不同，与测序检测方法相对应的文库构建方法应该给予充分的考虑，特别是要求和预期用途匹配。鉴于目前高通量测序技术的复杂程度，在文库构建、测序等技术过程中发生人为错误或意外的情况不能完全避免，应针对文库构建失败率进行限定，国家参考品中的文库构建失败率应不高于1%。

在母体血液中胎儿的游离DNA片段是随机的序列而不是一个固定的序列，尽管其浓度随着孕周增加而增加，但是其序列在每次采样时都会有不同。在现行的国家参考品中，考虑到降低数据量可能导致假阴性和假阳性的发生，单个样本数据量的要求是不低于3.5 M reads。采用片段化选择的方式对样本提取的游离DNA或文库构建后的产物等过程中进行片段筛选，可以提高胎儿游离DNA和母体游离DNA的相对比例，但其数据量控制要求仍需进行验证后提供合理的有效数据量控制指标。

NIPT检测DNA除胎儿游离DNA和母体游离DNA外，可能还有病原体的游离DNA、试剂中污染物种的DNA以及来自环境的DNA等。所以应分析样本中胎儿游离DNA的量、片段大小等特性。在现行国家参考品中，阴性参考品（其他类型染色体非整倍体和其他染色体正常阴性样本）应不得检出T21、T18和T13阳性。由于平均胎儿游离DNA浓度为10%左右，所以阳性参考品包括10%浓度的T21、T18和T13样本，要求检出率达到100%。70%胎盘异常嵌合体应全部检出，30%异常嵌合体可为检出或未检出。对于胎儿微缺失微重复，大于20 Mb的微缺失微重复应能检出，其余微缺失微重复参考品应不得检出T21、T18和T13阳性。检测限参考品的浓度一般为5%到3.5%。要求5%浓度检测限参考品（包括流产组织、高GC、胆红素和细胞系样本）应全部检出，3.5%浓度检测限参考品应准确检出不低于50%。此外，为考察试剂的重复性，应建立重复性考核指标。

4 染色体非整倍体无创产前检测技术临床应用进展

作为一个具有良好前景的新兴技术，NIPT临床应用在国内经历了无监管、叫停、监管3个阶段。2010年，美国Sequenom和Verinata Health等公司以第三方实验室的形式相继推出NIPT服务。同年北京贝瑞和康以及深圳华大基因也利用相似的技术进入无创产前诊断市场，随后安诺优达、达安基因、诺禾致源等公司相继进入染色体非整倍体无创产前检测市场。普遍采取的市场模式是由测序公司从医院收集样本后提供检测服务，但相关仪器和产品尚未获得医疗器械注册证，市场相对混乱，也严重影响了该技术在医院的推广度和普及率。2014年2月，国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA）和卫计委针对NIPT应用初始的混乱，联合发布《关于加强临床使用基因测序相关产品和技术管理的通知》［13］，在全国范围内叫停了NIPT 服务，但并非终止这项技术。2014年3月，国家卫计委医政医管局开始接受高通量测序技术的临床应用试点单位申报，并于2015年初，由国家卫计委妇幼司下发《国家卫生计生委妇幼司关于产前诊断机构开展高通量基因测序产前筛查与诊断临床应用试点工作的通知》［14］，明确规定了108家产前诊断机构作为试点单位开展NIPT项目。至此，NIPT第一阶段的临床应用正式开展。同时，2014～2015年，CFDA先后批准了华大基因、中山大学达安基因股份有限公司、北京博奥晶典生物技术有限公司和北京贝瑞和康生物技术有限公司的高通量测序仪和测序试剂。NIPT的应用逐渐走上正轨。经过了NIPT项目2年多的试点运营，卫生部门积累了NIPT项目开展、质量控制、监管方式等方面的经验。2016年8月8日，中国食品药品检定研究院发布《第二代测序技术检测试剂质量评价通用技术指导原则》［15］。2016年10月27日，卫计委发布了《国家卫生计生委办公厅关于规范有序开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断工作的通知》［16］，正式废止此前有关高通量基因测序产前筛查与诊断试点机构的相关规定，取消108家临床试点单位与9家医学检验所的临床试点。这意味着，原则上所有具备相关资质的医疗机构、医学检验所都可开展无创DNA产前筛查与诊断。2017年3月15日，中国食品药品检定研究院发布《基于孕妇游离DNA的胎儿染色体非整倍体检测试剂质量控制技术评价指南（高通量测序法）》［12］，进一步对产品规范给予指导性意见。至此，国家卫生部门对NIPT的限定性逐步放开，对NIPT在合理监管下广泛应用于全国起到巨大的推动作用，翻开了该技术临床应用的新篇章。2016年中国NIPT市场推广约200万人份，创造了30亿元～40亿元的销售额。在无创产前领域，无论是技术还是市场推广成熟度，中国都已处于国际领先地位。

2016年10月27日，卫计委发布的《国家卫生计生委办公厅关于规范有序开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断工作的通知》中明确指出，除孕周小于12周；夫妇一方有明确染色体异常；一年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗等；胎儿超声检查提示有结构异常须进行产前诊断；有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险；孕期合并恶性肿瘤；医师认为有明显影响结果准确性的其他情形；这7条作为不适用情形外，孕妇或其家属在充分知情同意情况下，皆可选择NIPT［16］。随着NIPT在临床应用上的广泛开展，NIPT在产前筛查的适应征又扩大到胎儿微缺失微重复综合征（microdeletion/microduplication syndrome，MD）的检测。MD是除染色体非整倍体之外的另一大引起新生儿出生缺陷的遗传性因素，是一类由于染色体拷贝数变异（copy number variation，CNV）而致的具有复杂表型的综合征性疾病。MD患者往往有智力发育障碍伴有或不伴结构异常。目前对MD的产前诊断多局限在已有先证者的病例或者超声检查异常的病例，没有生化标志物可筛查MD。通过传统的产前筛查方式，如果胎儿携带致病的CNV但是胎儿超声提示未见异常，该样本就错失了产前诊断的机会。自从2011年首例报道应用NIPT进行MD的产前诊断后［17］，又有多篇基于NGS技术无创检测MD的相关案例［17⁃25］。这些研究证实了NIPT 用于胎儿 MD检测的可行性，但需要较目前NIPT方法更高的胎儿游离DNA浓度和测序深度，从经济学角度考虑尚不适宜进行大范围的临床推广。多篇研究通过改进算法提高检测的灵敏度，从而降低微重复微缺失检测所需的测序深度，可以在一定程度上降低成本［26⁃29］。基于此，国外的 NIPT 检测巨头Natera、Sequenom、Verinata Health等机构扩大了NIPT的筛查范围，开始通过临床实验室改进法案（clinical laboratory improvement amendments，CLIA）认证实验室提供MD的商业检测服务，范围主要涉及 22q11.2微缺失（DiGeorge）、Angelman、Jacovsen、1p36 微缺失、Cri⁃du⁃chat、Prader⁃Willi、Langer⁃Giedion 和 Wolf⁃Hirschhorn 综合征这几种发病率较高的MD综合征。国内的华大基因和贝瑞和康也分别升级了各自NIPT检测的服务范围，同样也提供如22q11.2微缺失、Angelman等综合征的检测结果。同时国际上部分学会和组织也出台了相关指南和共识。ACOG和ISPD在2015年针对NIPT检测更新了指南，ACOG保守地指出对于MD的筛查尚未被临床验证，其灵敏性和特异性也没有确切证据；ISPD则表示NIPT扩增检测应当限定在研究清楚的MD综合征范围内，并需要结合临床指针共同判断。2016年7月ACMG发表最新声明：对于已知CNVs，医生应该在检测之前充分告知孕妇NIPT检测范围会扩大至CNVs，并且CNVs检测结果具有较高的假阳性和假阴性。但如果NIPT发现了CNVs，应该进行产前诊断验证［11］。结合目前的研究进展和指南建议，用NIPT的方法检测5 Mb以上且具有较为明确临床意义的CNV具有一定可行性，但仍缺乏大规模前瞻性的CNV临床检测数据，用于商业化的临床筛查应慎重使用。

5 小结与展望

政策支持和超高的灵敏度使NIPT成为染色体非整倍体临床筛查的主要技术手段。2016年NIPT全国检测数量约200万人次，普及率10%左右。其在大中城市的普及率已大于15%，并有较快的增长率。部分发达地区甚至已经提出利用该技术来基本消灭唐氏综合征。但是，我们还应看到NIPT项目的普及仍有巨大的提升空间，并存在明显的不均衡。偏远地区的NIPT检测无论是就检测数量还是地区覆盖率而言，与发达地区相比均有明显的差距。即使NIPT价格呈逐年下降的趋势，但相对于传统的唐筛项目而言，检测价格仍处于较高水平。并且因为NIPT检测费用并未纳入医疗保险，对于全国绝大多数地区，尤其是县级市及下属区、镇及农村的家庭而言，其检测费用过于昂贵，在无政府补贴的情况下，大部分家庭尚不倾向于进行NIPT检测。同时全国能够开展NIPT检查项目的医疗机构仍处于刚刚放开的阶段，大部分医疗机构在医疗环境和医疗人员技术要求上尚不能满足临床需求。由此，积极提升医疗人员技术水平、大力提高无创产前筛查的总体普及率、尽量减少不同地区检测水平的不均衡性，对降低出生缺陷率、提高整体优生优育水平十分重要。

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Quality control and clinical application of non⁃invasive prenatal test for chromosomal aneuploidy

QU Shoufang1，YU Ting1，SUN Nan1，LI Lili1，CHEN Fang2，WU Yingsong3，HUANG Jie1★
（1.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing，China，100050；2.China National Genebank，Shenzhen，Guangdong,China，518083；3.School of Laboratory Medicine and Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Non⁃invasive prenatal testing(NIPT)for fetal aneuploidies by next generation sequencing of maternal plasma DNA is a developing,innovative technology.This technology is highly sensitive and specific and has been validated in multiple clinical trials.NIPT has been recommended as the priorities for fetal aneuploidy by several professional societies.However,in consideration of the complicated workflow and many influencing factors,quality control throughout the entire process,such as sample collection and transportation,cfDNA isolation,library construction,sequencing,data analysis,is essential.Likewise,because of complex reagent ingredients,difficult technical requirements and high social concerns,it is also necessary to define the product performance criteria.In view of this,the issue of quality control,specifications and the progress of the clinical application progress of NIPT based on NGS technology will be briefly commented in this paper.

NIPT;NGS;Quality control points;Product specification

广州市重大科技攻关项目（2014Y2⁃00220）

★通讯作者：黄杰，E⁃mail：jhuang5522@126.com