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(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

流化床结合大孔吸附树脂富集葡萄酒中的白藜芦醇

刘贵珊,房盟盟,冯愈钦,郭红艳,何建国

(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

本文研究了自行搭建的流化床富集装置结合大孔吸附树脂对葡萄酒中白藜芦醇的富集方法。通过静态吸附实验比较了HPD826、DA-201、AB-8、H103和HPD600五种大孔吸附树脂的富集效果,进而筛选出最优吸附树脂,并将其应用于流化床中富集葡萄酒中的白藜芦醇。结果表明,流化床富集装置可确保流体均匀流动;大孔树脂可提高葡萄酒中白藜芦醇的富集效率,其中H103树脂的富集效果最优,吸附率达到94.00%;H103树脂动态吸附的最佳条件为酒样流速1.5 BV/h,保持酒样原液pH不变,解析条件为先水洗,再以1.0 BV/h流速、质量分数为80%乙醇溶液洗,酒样中白藜芦醇的吸附率可达89.4%,解析率为93.6%;经HPLC检测证明,在树脂量为0.0120 g,酒样流速为1.5 BV/h的条件下,流出液中基本不含白藜芦醇。

葡萄酒,白藜芦醇,流化床富集,大孔吸附树脂,高效液相色谱

白藜芦醇(Resveratrol)是植物体内产生的一种天然二苯乙烯类多酚物质[1],具有抗癌、抗真菌、抗氧化、抗自由基、保肝、利肝等多种生物学活性,广泛应用于食品、化妆品、医药等领域[2-3]。1998年,美国艾尔·敏德尔编撰《抗衰老圣典》时,将白藜芦醇列为“100种最热门有效抗衰老物质”之一。因此,白藜芦醇的分离纯化受到了极大的关注。

目前,常见的白藜芦醇传统富集方法有吸附、萃取、沉淀、离子交换等[4-5]。富集材料分为无机富集材料和有机富集材料。无机吸附材料有活性炭、二氧化硅、硅胶、金属氧化物等;有机富集材料包括吸附树脂(大孔吸附树脂、微孔吸附树脂)、纤维素、壳聚糖、生物藻等。其中,大孔吸附树脂是上世纪60年代发展起来的有机高分子富集材料,吸附容量大、选择性好、性质稳定、强度高、可再生利用[6]。国内外学者在白藜芦醇富集、提取等方面不断探索研究。向海燕[7]等发现植物精提复合酶对虎杖中的白藜芦醇酶解效果较好,从而优化了酶解工艺;蒋明廉[8]用多层膜法分离虎杖中的白藜芦醇,使其纯度达到95%以上;Bernar等用乙醇-二氧化碳共溶剂提取白藜芦醇,结果表明,本方法能够满足对样品灵敏、快速、高通量、低溶剂的检测要求,适用于白藜芦醇提取;康彥芳[9]等用超声波法从葡萄穗轴废渣中提取白藜芦醇,并得到了最佳提取条件,大大缩短提取时间,提高有效成分的提取率。这些不断发展的酶解法、膜分离法、双水相提取技术、超声波提取法等技术,还都有待于人们进一步探索和研究,而各个方法的联用也将成为未来的发展方向[10]。

本研究自行搭建流化床富集装置,利用预处理后的HPD826、DA-201、AB-8、H103和HPD600五种大孔吸附树脂,直接对葡萄酒样品进行吸附,采用静态吸附-解析筛选大孔吸附树脂,优选吸附白藜芦醇效果最优的树脂,并进行动态吸附条件的优化及富集效果的评价,进而寻找快速高效富集白藜芦醇的新方法。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

2014年蛇龙珠干红葡萄酒 宁夏西夏王葡萄酒业有限公司;HPD826、HPD600、H103、DA201、AB-8五种大孔吸附树脂 郑州勤实科技有限公司;甲醇 色谱纯,天津科密欧化学试剂有限公司;乙腈 色谱纯,美国CHROMADEX公司;白藜芦醇标品 中国食品药品检定研究所;无水乙醇、盐酸、氢氧化钠 均为分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司。

HY-4型调速振荡仪 常州国华电器有限公司;BT-50EA/153YX型蠕动泵 重庆杰恒蠕动泵有限公司;SHB-IIIS型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;pHS-25型pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;AGILENT1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司;一次性有机滤器 0.45 μm×13 mm;滤膜 0.45 μm×50 mm;滤网 80目。

1.2流化床富集装置的搭建

流化床富集装置主要包括五个部分:富集容器、蠕动泵、料液罐、T型管以及废液罐(见图1)。流化床反应器是一种利用气体或液体通过颗粒状固体层而使固体颗粒处于悬浮运动状态,并进行气固相反应过程或液固相反应过程的反应器[11-12]。该反应器采用挡网等作为内部构件,结构简单,制造容易,设备容积利用率高。由图1可知,蠕动泵和重力势能可提供其循环流动的动力来源,富集容器将葡萄酒与吸附树脂充分接触后又有效分离。实验过程中,需改变蠕动泵的转速,便可调节整个循环系统的富集速度;同时,结合实际需求灵活调控富集时间,使富集效果达到最优。富集完毕后关闭阀门4,液体流到废液罐中;移除富集装置,取出提取处理后的树脂。

图1 富集装置Fig.1 Enrichment apparatus注:1.富集容器,2.储液罐,3.T型管,4.阀门,5.铁架台,6.废液罐,7.蠕动泵,8.软管。

1.3大孔吸附树脂的预处理

生产和销售大孔吸附树脂的过程中,难以避免未聚合单体、致孔剂、交联剂、分散剂、防腐剂等残留物的存在,为保证树脂的纯净性和安全性,使用前需要去除这些物质[13]。用自制的超纯水溶胀HPD826、HPD600、H103、DA201、AB-8五种大孔吸附树脂,去除漂浮物;用质量分数5%的盐酸溶液浸泡树脂,搅拌使其和盐酸充分接触,4 h后水洗至pH试纸检测为中性;再用质量分数2%的氢氧化钠溶液浸泡,4 h后水洗至接近中性;最后用体积分数为95%乙醇浸泡24 h,水洗至无醇味且无浑浊现象,室温下密封保存备用。

1.4静态吸附-解析筛选大孔吸附树脂实验

用真空泵抽提预处理过的树脂4 min,去除表面水分,分别称取HPD826、DA-201、AB-8、H103、HPD600湿树脂各0.0120 g,并各加入60.0 mL酒样,密封在150 mL带塞三角瓶中,调节振荡器振荡频率为140次/min,室温下振荡24 h,达到充分吸附。然后过滤树脂,高效液相色谱法检测滤液中白藜芦醇的浓度,根据公式(1)、公式(2)计算不同大孔吸附树脂的吸附量和吸附率。过滤后的树脂用清水洗涤,加入50.0 mL体积浓度为80%的乙醇溶液,室温下振荡解析24 h,高效液相色谱法检测解析液中白藜芦醇的浓度,依据公式(3)计算解析率。根据吸附量、吸附率和解析率优选分离富集白藜芦醇的大孔吸附树脂。

式(1)

式(2)

式(3)

其中,C1-吸附前原液的浓度,mg/L;C2-吸附平衡时原液的浓度,mg/L;V1-吸附原液的体积,mL;W-干树脂的质量,g;C3-洗脱液的浓度,mg/L;V2-洗脱液的体积,mL。

1.5静态吸附动力学实验

选取H103树脂,加入60.0 mL酒样,置于带塞三角瓶中,室温下在振荡器中进行静态吸附实验从1.5 h开始每隔1 h取上清液,高效液色谱法检测其浓度,计算不同时间H103树脂对白藜芦醇的吸附量,研究其静态吸附动力学特征。

1.6动态吸附-解析实验

选取H103树脂进行动态吸附实验,将其装入吸附柱中,酒样通入树脂,控制流速,每8.0 mL收集一管流出液,检测到当其浓度为原液浓度的0.1倍时,认为已经达到穿漏点,停止上样,计算吸附率。

保持酒样本身pH,调节蠕动泵,控制酒样的流速分别为0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 BV/h,检测吸附前后酒样浓度,以吸附率(%)为纵坐标(Y),流速(BV/h)为横坐标(X)作图,研究流速对动态吸附的影响。

采用质量浓度10%的盐酸、质量浓度10%的氢氧化钠调节酒液的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0,控制酒样流速为1.5 BV/h,以吸附率(%)为纵坐标(Y),pH为横坐标(X)作图,研究酒样的pH对动态吸附的影响。

酒样以1.5 BV/h的速度通过H103大孔吸附树脂进行吸附结束后,先用4 BV的水冲洗树脂,再用一定浓度的乙醇水溶液解析树脂。实验配制不同体积浓度的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%),以1.0 BV/h的速度洗脱,分步收集流出液,每8.0 mL取一管,检测其浓度,计算解析率。

水洗已经达到吸附平衡的树脂,用体积浓度80%的乙醇洗脱,控制流速为0.5、1.0、1.5、2.0 BV/h,分步收集洗脱液,测定其浓度,计算解析率。

1.7树脂的再生实验

由于大孔吸附树脂的机械强度(指树脂承受抗压、抗变形的能力,与树脂孔隙率和制备工艺有关系,孔体积越大,则强度越差,其强度直接影响树脂的使用寿命)较好,因此可以被多次回收利用,回收前要进行再生操作,除去树脂吸附的杂质,恢复性能。采用体积浓度95%的乙醇对大孔吸附树脂进行洗脱,吸附过的树脂由棕红色变为棕红褐色,再用配制的质量分数5%的氢氧化钠溶液和1.0 mol/L的盐酸溶液浸泡并洗涤,最后用大量超纯水洗至接近中性。

1.8富集效果评价实验

将洗脱液用乙酸乙酯萃取15 min,静置分层后取上清液,设置旋转蒸发仪的条件为0.9 MPa,温度50 ℃,旋转蒸发至干,甲醇溶解残渣,采用高效液相色谱法检测酒样中白藜芦醇的含量变化,鉴定大孔吸附树脂对白藜芦醇的吸附效果。

1.9 HPLC法测定白藜芦醇含量

采用AQ-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色谱柱,二极管阵列检测器(DAD 检测器),进样量为10 μL,流速为1.0 mL/min,柱温30 ℃,检测波长306 nm[14]。梯度洗脱:A为去离子水(pH=2.4),B为纯乙腈,起始时A∶B=65∶35(体积比),0～10 min保持35% B;10～20 min内,35%～100% B;20～30 min保持100% B;30～35 min内,100%～35% B;35～40 min,保持35% B。吸附前酒样用0.45 μm有机滤器过滤,流动相用0.45 μm有机滤膜过滤,并超声振荡5 min。

使用电子天平准确称取白藜芦醇标品5.0000 mg,溶解于色谱级甲醇中,于100 mL棕色容量瓶定容,摇匀,配成50.0 mg/L的标准溶液作为母液,待用。精密吸取适量母液,用甲醇配制成1.0、2.0、6.0、10.0、20.0 mg/L系列浓度梯度的标准溶液。按照浓度从小到大的顺序,依次准确吸取标准溶液,在相同色谱条件下进样检测,得到对应峰面积。

2 结果与讨论

2.1大孔吸附树脂的筛选

五种大孔吸附树脂各自的表面性质对树脂的吸附性能有重要影响,白藜芦醇是多酚类物质,每个分子含三个酚羟基,显示弱极性,所以有利于弱极性或极性树脂的吸附[15]。优良的树脂不但应当有良好的吸附性能,还应当有较好的解析性能,以便于树脂的回收利用和有效成分的回收[16]。不同树脂对白藜芦醇的静态吸附结果见表1。由表1可知,五种吸附树脂中,H103树脂的平衡吸附量最大,为30.00 mg/g,其吸附率为94.00%,解析率也较高,为90.42%。综合考虑后,选用H103树脂为最佳树脂。

表1 不同树脂对白藜芦醇的吸附洗脱性能Table 1 Different resin adsorption elution performance of resveratrol

2.2 H103树脂吸附特性及洗脱条件研究

2.2.1 H103树脂静态吸附动力学特性 静态吸附动力学特性也是评价树脂吸附特性的一个指标,以吸附量(mg/g)为纵坐标(Y),时间t(h)为横坐标(X)作图,得到H103树脂的吸附动力学曲线(见图2)。由图2可知,1.5～2.5 h内,H103树脂内表面大量的活性吸附中心发挥作用,吸附速度较快;随后,可发挥作用的活性中心逐渐减少,吸附速度随之逐渐降低;4.5 h后吸附趋于缓和,5.5 h后,吸附量为28.70 mg/g,吸附接近平衡状态。说明H103树脂吸附速率快,属于快速平衡型树脂。

图2 H103树脂的吸附动力学曲线Fig.2 H103 resin adsorption kinetics curves

2.2.2 流速对吸附的影响 以吸附率(%)为纵坐标(Y),流速(BV/h)为横坐标(X)作图,研究流速对吸附的影响(见图3)。由图3可知,当酒样流速较小时,酒样流速的变化对大孔树脂的吸附能力影响很大,树脂对白藜芦醇的吸附率高,但吸附过程缓慢,工作时间长;当流速增大时,吸附率表现出降低的趋势,当流速达到1.5 BV/h以后,泄漏点出现。所以选择1.5 BV/h为最佳吸附流速,此时吸附率为89.4%。

图3 流速对吸附率的影响 Fig. 3 The influence of the velocity on adsorption rate

2.2.3 酒样pH对吸附的影响 酒样pH不同,对吸附效果有影响,以吸附率(%)为纵坐标(Y),酒样pH为横坐标(X)作图(见图4)。由图4可知,pH=4.0时,H103大孔吸附树脂对白藜芦醇的吸附率最高,为91.1%;当上样液的pH>4.0时,随着pH的升高,吸附率逐渐降低。这是因为白藜芦醇分子上带有三个酚羟基,是弱酸性物质,在酸性或弱酸性环境中其解离受到抑制,有利于白藜芦醇以分子形式从溶液进入树脂孔道被吸附;如果酸性过强,白藜芦醇容易形成佯盐,不利于吸附的进行。由于葡萄酒的pH范围一般在2.7～3.8,所以后续富集实验不进行pH的调节。

图4 酒样pH对吸附率的影响Fig.4 The influence of liquor pH on the adsorption rate

2.2.4 洗脱方式的确定 洗脱体系需要对目标物有良好的溶解能力,并且对树脂有溶胀作用,以便于从树脂上洗脱并溶解目标物。常用的洗脱体系由醇类(甲醇、乙醇)、丙酮、乙酸乙酯、水等构成,结合经济性和安全性,实验选用水-乙醇作为洗脱体系。以解析率(%)为纵坐标(Y),乙醇浓度(%)为横坐标(X)作图,研究乙醇-水洗脱液中乙醇的浓度对洗脱效果的影响(见图5)。由图5可知,随着洗脱体系中乙醇浓度的增加,解析率变大;乙醇体积浓度超过80%以后,洗脱率在90%以上,且乙醇浓度继续增加而洗脱率趋势平缓。乙醇的浓度越大,洗脱体系极性越大,对白藜芦醇的分子作用力越强,同时对白藜芦醇的溶解性也越好,因而洗脱率效果也越好。实验发现体积浓度为80%的乙醇溶液即可达到良好的洗脱效果,所以确定的洗脱方式为先用4 BV的水洗,再用体积浓度80%的乙醇溶液洗脱。

图5 乙醇浓度对解析率的影响Fig.5 The influence of ethanol concentration on the resolution

2.2.5 洗脱流速的确定 研究洗脱流速对解析效果的影响(见图6)。由图6可知,洗脱速度增大,解析率降低,流速超过1.0 BV/h后,乙醇溶液与树脂上的白藜芦醇接触时间过短,洗脱效果差,乙醇的用量也增加;当流速为0.5 BV/h时,解析率最高,但是效率过低,工作时间长。所以洗脱速度为1.0 BV/h为最佳洗脱速度,此时对白藜芦醇的洗脱率为93.6%。

图6 流速对解析率的影响Fig.6 The influence of velocity on the resolution

2.3 HPLC方法考察

以标准溶液的质量浓度(mg/L)为横坐标(X),相应色谱峰的出峰面积(Au)为纵坐标(Y),以Y对X进行线性回归,考察白藜芦醇的线性回归方程、线性范围和相关系数(见图7)。由图7可知,白藜芦醇的线性回归方程为:y=81.474x+5.3219,R2=0.9999,线性范围为1～20 mg/L,该范围内白藜芦醇的质量浓度和峰面积的线性关系良好,可以满足定量分析的要求。

图7 白藜芦醇的标准曲线Fig.7 The standard curve of resveratrol

2.4富集效果评价

HPLC法检测吸附前后葡萄酒中白藜芦醇的含量变化(见图7)。由白藜芦醇标品的高效液相色谱图7(a)可知:保留时间为7.47 min左右时,有白藜芦醇的特征色谱峰出现,其峰值达420 mAU,峰形、分离效果均较好,标品中保留22 min处为甲醇的吸收峰。从吸附前后的色谱图7(a)及7(b)比对标样色谱可以看出在7.47 min时,吸附前白藜芦醇峰值达30 mAU,被吸附树脂吸附后的红葡萄酒样中白藜芦醇峰值仅为1 mAU,数值明显降低,可确定吸附树脂对白藜芦醇有很好的吸附效果。

图8 吸附前后酒样的高效液相色谱图Fig.8 HPLC chromatograms of wine samples before and after adsorption注：a:标样；b:吸附前；c:吸附后。

3 结论

流化床富集装置内的吸附树脂像流体一样运动,并在悬浮状态下与流体接触,流固相界面积大,有利于非均相反应的进行,使流化更趋平稳,反应不致过分集中在底部,吸附树脂可与葡萄酒均匀接触,提高了富集效率。

本文研究比较HPD826、DA-201、AB-8、H103、HPD600五种大孔吸附树脂对葡萄酒中白藜芦醇富集效果,通过静态吸附发现H103吸附率最高,吸附率达到94.00%,解析率也较高,为90.42%。将其应用于流化床中动态富集葡萄酒中的白藜芦醇,发现其吸附动力学特性良好,能较快达到吸附平衡,为实验的最优树脂。对H103大孔吸附树脂的动态吸附工艺进行优化,最佳条件为酒样流速1.5 BV/h,保持酒样原液pH不变,解析条件为先水洗,再以1.0 BV/h流速,质量分数80%的乙醇溶液洗,酒样中白藜芦醇的吸附率可达89.4%,解析率为93.6%;经高效液相色谱法检测,从吸附前后的色谱图比对标样色谱可以看出在7.47 min时,吸附前白藜芦醇峰值达30 mAU,被吸附树脂吸附后的红葡萄酒样中白藜芦醇峰值仅为1 mAU,数值明显降低,证明H103大孔吸附树脂对葡萄酒中白藜芦醇有良好的富集作用。

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Enrichmentofresveratrolfromwinebasedonfluidizedbedandmacroporousadsorptionresin

LIUGui-shan,FANGMeng-meng,FENGYu-qin,GUOHong-yan,HEJian-guo

(School of Agriculture,Ningxia University,Yinchuan 750021,China)

The enrichment effect of resveratrol in wine based on fluidized bed and five macroporous adsorption resins by building a fluidized bed enrichment device was explored in this paper. The enrichment effect of HPD826,DA-201,AB-8,H103 and HPD600 macroporous adsorption resins was compared by static adsorption test. The optimum adsorption resin was screened and applied to the enrichment resveratrol of wine in fluidized bed. The results showed that the fluidized bed enrichment device could ensure the uniform flow of fluid. Macroporous resins could improve the enrichment efficiency of resveratrol in wine,and the enrichment effect of H103 resin was the best,which was 94.00%.The optimum conditions for the dynamic adsorption of H103 resin were as follows:the flow rate of the sample was 1.5 BV/h,and the pH of the wine was kept constant. The analytical conditions were the first washing,mass fraction of 80% ethanol solution was washed with 1.0 BV/h,the adsorption rate of resveratrol was 89.4% and the resolution rate was 93.6%. When the resin amount was 0.0120 g and the liquor flow rate was 1.5 BV/h,the result of HPLC showed that flow rate of wine sample.

wine;resveratrol;fluidized bed enrichment;macroporous adsorption resin;HPLC

2016-11-04

刘贵珊(1979-)，男，博士，副教授，主要从事功能性食品营养与评价方面的研究，E-mail：liugs@nxu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31401480)。

TS207.3

:B

:1002-0306(2017)16-0220-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.16.041