崔明宇，王洪梅，李聪慧，张 凯，孔晓悦，马英丽

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

P-gp抑制剂对蓬子菜活性成分肠吸收的影响

崔明宇，王洪梅，李聪慧，张 凯，孔晓悦，马英丽

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

考察P-gp抑制剂对蓬子菜中活性成分肠吸收的促进作用.采用大鼠肠襻模型及HPLC测定方法，以活性成分DXG的剩余百分数(R%)和肠吸收转化率(A%)为评价指标，考察P-gp抑制剂对蓬子菜中活性成分肠吸收的影响.结果表明,与对照组相比，各组DXG剩余百分数减少，单位时间吸收转化率增加，蓬子菜中活性成分的肠吸收增加. P-gp抑制剂通过竞争性抑制作用，对蓬子菜中活性成分的肠吸收具有一定促进作用，可提高蓬子菜活性成分的生物利用度，为蓬子菜的新药研究提供新的科学依据.

蓬子菜；DXG；P-gp抑制剂；肠吸收

蓬子菜来自植物蓬子菜(Galiumverum L.)的干燥全草，始载于《救荒本草》.作为一种天然药物，其具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多方面的药理作用.蓬子菜中含有黄酮、蒽醌、环烯醚萜、有机酸等多类化学成分，其中黄酮类化合物为主要活性成分.文献报道，蓬子菜中黄酮类化合物可显著抑制人肝癌细胞HepG2[1]、急性早幼粒细胞白血病NB4细胞[2]、人咽鳞癌细胞FADU[3-4]的增殖并诱导其凋亡；对氧化损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)具有保护及修复作用[5]；自由基清除实验中体现出良好的抗氧化活性[6].

DXG[diosmetin-7-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside]为从蓬子菜黄酮类化合物中分离得到的高含量活性成分，但研究发现其吸收较差，文献研究表明DXG为P-gp底物[7]，因P-gp的外排作用而影响吸收.本文采用在体肠襻模型考察P-gp抑制剂(维拉帕米和地高辛)对DXG吸收的的影响，为提高其生物利用度及新药开发提供科学依据.

1 实验材料

1.1药品与试剂

DXG标准品(质量分数≥98%)(实验室自制)、蓬子菜总黄酮，含DXG量为8.8%(实验室自制)、盐酸维拉帕米(VP，天津市中央药业有限公司)、地高辛(DIG，上海源叶生物科技有限公司，批号RM0331FD14)、水合氯醛(天津市光复精细化工研究所，批号HG3-1004-76).色谱甲醇(DIMA公司)、磷酸、NaCl、KCl、CaCl2、NaHCO3、NaH2PO4、MgC12、葡萄糖.

1.2实验仪器

LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，SPD-10A紫外检测器，CLASS-VP工作站，BT25S电子天平(德国Sartorius)，TGL-16C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，XW-80A蜗旋混合器(上海医用仪器厂).

1.3实验动物

SD大鼠(200±20)g，雄性，青岛派特福德白鼠养殖公司提供，动物许可证号：SCXK(鲁)2014-0007.

2 实验方法

2.1溶液的配制

K-R液的配制：称取NaCl 7.8 g，KCl0.35 g，CaCl20.37 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgC120.02 g，葡萄糖1.4 g，加蒸馏水定容至1 000 mL.

供试液的配制：

精密称定蓬子菜总黄酮，置10 mL容量瓶中，加K-R液超声溶解，放冷后定容至刻度，摇匀，得浓度为1.0 mg/mL的蓬子菜总黄酮供试液.

精密称定蓬子菜总黄酮及VP，余法同上，得DXG质量浓度为80 μg/mL、VP质量浓度为0.1 mg/mL的蓬子菜总黄酮供试液.

精密称定蓬子菜总黄酮及DIG，余法同上，得DXG质量浓度为80 μg/mL、DIG质量浓度为0.5 mg/mL的蓬子菜总黄酮供试液.

2.2标准对照液的制备

精密称取DXG标准品0.8 mg，置10 mL容量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，得80 μg/mL的标准对照液.

2.2.1 色谱条件

Class-VP色谱数据工作站；Hyperisil ODS-2(4.6 mm*250 mm，5 μm)(大连伊利特公司)；流动相：甲醇-0.2%磷酸水(38∶62)；检测波长：340 nm；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；进样量20 μL.

2.2.2 样品处理

精密吸取样品溶液0.5 mL，加甲醇1.0 mL，涡旋混合3 min，15 000 r/min离心5 min，取上清液0.45 μm微孔滤膜过滤后进样.

2.3肠襻实验

SD大鼠(体重200±20)g，分为蓬子菜总黄酮组、蓬子菜总黄酮+VP组、蓬子菜总黄酮+DIG组，每组5只，实验前禁食12 h(自由饮水).水合氯醛30 mg/kg腹腔注射麻醉并固定，沿腹中线切开腹腔，暴露小肠并结扎胆总管，将供试液注入肠襻后，肠襻放回腹腔并缝合腹壁，维持体温37 ℃，于灌注3 h后，剪下肠襻，将肠内容物转移至10 mL容量瓶中，用K-R液少量多次洗涤肠襻，洗涤液完全转移至上述量瓶中，以K-R液定容，摇匀，HPLC法测定剩余药物量，量瓶中药物质量浓度作为终质量浓度，肠灌注液中起始药物质量浓度作为初始质量浓度[8].

2.4肠襻法参数计算

剩余百分数(R%)：

R%=(Ct×Vt)/(Co×C0)×100%

单位时间吸收转化率(A%)：

其中：C0为灌注液药物初始质量浓度(μg·mL-1)；V0为灌注液初始体积(mL)；Ct为t时刻灌注液药物质量浓度(μg·mL-1)；Vt：t时刻灌注液体积(mL)；t(h)：孵育时间(h).

2.5数据处理

3 实验结果

3.1方法学考察

3.1.1 专属性

分别取肠内容物溶液、对照品溶液、肠内容物+对照品溶液、样品溶液，按样品处理方法处理后，在上述色谱条件下测定.结果表明，肠内源性物质无干扰，专属性良好.见图1.

图1 (A)肠内容物溶液 (B)对照品溶液 (C)肠内容物+对照品溶液 (D)样品溶液

3.1.2 线性关系

取标准对照液以甲醇稀释至DXG质量浓度为20 μg/mL，分别取2、3、4、5、6、10、20 μL系列溶液，于2.2.1色谱条件下进样，以DXG质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程：A=15 415C-227 7(R2=0.998 2).结果表明回归方程在2～20 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好.

3.1.3 精密度实验

取高、中、低3个不同质量浓度对照品溶液，在上述色谱条件下每次20 μL重复进样5次，连续测定5 d，考察方法的日内与日间精密度，见表1，日内和日间精密度的RSD均小于10%，符合生物样品测定中对精密度的要求.

成分名称质量浓度/(μg·mL-1)日内日间实测质量浓度/(μg·mL-1)RSD/%实测质量浓度/(μg·mL-1)RSD/%2020．09±0．290．7220．03±0．240．45DXG1010．22±0．190．3810．26±0．210．6454．86±0．201．084．85±0．170．56

3.1.4 回收率

取标准对照液不同体积，置10 mL容量瓶中，以水∶甲醇(1∶2；V/V)将其定容至刻度，充分摇匀，得到三组质量浓度分别为高、中、低的对照品溶液在上述色谱条件下测定，计算回收率，见表2，回收率(RSD)均小于10%，符合生物样品测定的要求.

成分名称质量浓度/(μg·mL-1)实测质量浓度/(μg·mL-1)RSD/%回收率/%16．215．77±0．361．33104．19DXG8．18．08±0．332．399．704．054．22±0．170．4997．34

3.1.5 稳定性

K-R液中的稳定性：取DXG 0.4 mg，置10 mL容量瓶中，用K-R液超声溶解，定容至刻度得到质量浓度为80 μg/mL的DXG样品溶液，按样品处理方法处理，于0、1、2、3、12 h考察样品溶液在室温下的稳定性.

肠内容物中的稳定性：取大鼠肠纵向剖开，K-R液洗净，将内容物及洗涤液置10 mL容量瓶中，精密称取DXG 0.4 mg加入其中，超声混匀，定容至刻度，置37 ℃水浴中孵育，分别于0、1、2、3、12 h取样考察样品溶液在肠灌注液孵育过程中的稳定性.见表3.

结果表明，样品在K-R液及肠内容物中具有良好的稳定性，符合生物样品测定要求.

表3DXG在K-R液及肠内容物中的稳定性

成分名称质量浓度/(μg·mL-1)0h1h2h3h12hRSD/%K-R液10098．3797．5298．6097．720．527肠内容物100105．17101．4898．2399．632．97

3.2 P-gp抑制剂对蓬子菜有效部位中DXG大鼠肠吸收的影响

实验结果表明，与对照组相比，加入P-gp抑制剂VP、DIG，蓬子菜有效部位中DXG的吸收有所增加，说明可通过加入P-gp抑制剂抑制P-gp的外排作用来提高P-gp底物成分的吸收.见表4.

成分名称空白组地高辛组维拉帕米组R%29．13±0．6117．26±4．21∗∗18．79±4．09∗A%23．63±0．2127．58±1．28∗∗27．07±1．36∗

注：与对照组比较，*P<0.05,**P<0.01

4 讨 论

改善药物的胃肠道吸收是提高其生物利用度的关键，影响药物胃肠道吸收的因素除药物自身的理化性质，机体的生物因素也是影响吸收的重要因素，如生物膜的屏障作用、P-gp的外排作用等.针对不用影响因素，采用适当的方法可有效改善药物胃肠道吸收，从而减少剂型设计的盲目性，对制剂处方研究有一定指导意义.

文献报道，蓬子菜中黄酮类化合物DXG为P-gp底物，吸收过程中因P-gp外排作用而导致吸收差，生物利用度低[9].本研究在前期实验中考察蓬子菜有效部位中DXG质量浓度分别为40、80、160 μg/mL时的吸收情况，结果表明DXG质量浓度在160 μg/mL时吸收不具有良好的剂量依赖性，故本研究采取中间质量浓度80 μg/mL考察加入P-gp抑制剂对吸收的进一步影响，结果表明P-gp抑制剂DIG及VP促吸收效果较好，对蓬子菜中活性成分的肠吸收具有一定的促进作用，可作为提高蓬子菜活性成分生物利用度的手段.

本研究在后续实验中，将进一步开展P-gp抑制剂与吸收促进剂二者联用后的促吸收效果、联用的安全性、吸收促进剂对P-gp底物成分的促吸收作用的广泛适用性.

[1] 李海霞, 马英丽, 史灵恩, 等. 蓬子菜黄酮类化合物对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的机制研究[J]. 中草药, 2013,44(10): 1290-1294.

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IntestinalloopmodelforeffectofP-gpinhibitoronintestinalabsorptionofactiveingredientfromGaliumverumL.

CUI Ming-yu, WANG Hong-mei, LI Cong-hui, ZHANG Kai, KONG Xiao-yue, MA Ying-li

(School of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

To study on the effect of P-gp inhibitor onintestinal absorption of active ingredient from Galiumverum L., the intestinal loop model and HPLC were used. Percentage of residual and conversion rate of absorption were evaluation parameter. Results indicated that compared with the control group, percentage of residual was decreasing and conversion rate of absorption was increasing respectively. Absorption of active ingredient from Galiumverum L. was improved well. P-gp inhibitor could increase intestinal absorption and improve the bioavailability of active ingredient from Galiumverum L., which canprovide the basis for research of Galiumverum L.

Galiumverum L.; DXG; P-gp inhibitor; intestinal absorption

2016-12-10.

黑龙江省自然科学基金项目(H2015044)；黑龙江省教育厅项目(12531625)；国家自然科学基金项目(201281274034)；黑龙江中医药大学研究生创新科研项目(yjscx2016049)

崔明宇(1971-)，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：中药活性成分及其药物动力学.

R285

：A

1672-0946(2017)04-0390-04