王崇益，隽海龙，李 浩

(1. 江苏正大清江制药有限公司，江苏 淮安223005；2. 淮安市第一人民医院，江苏 淮安223001)

高效液相色谱法测定益肾蠲痹丸中的马兜铃酸A

王崇益1，隽海龙1，李 浩2

(1. 江苏正大清江制药有限公司，江苏 淮安223005；2. 淮安市第一人民医院，江苏 淮安223001)

建立一种灵敏度高，重现性好的马兜铃酸A含量测定方法，用于益肾蠲痹丸中的马兜铃酸A的限度检查.采用高效液相色谱法.色谱柱：填料为 Diamonsil C18，5 μm， 4.6×250 mm柱，迪马公司；流动相：甲醇-水-冰醋酸(69∶30∶1)；流速：1.0 mL/min；柱温：3 5℃；检测波长：250 nm.马兜铃酸A在0.011～0.304 μg之间时，线性关系良好.的回归方程Y=5 308 818Χ-4 676，相关系数r=0.999 9，方法的回收率(n=9)为99.31%.建立的含量测定方法准确、灵敏，专属性强，重现性好.

马兜铃酸A；益肾蠲痹丸；含量测定；高效液相色谱法

益肾蠲痹丸的处方来源于国医大师朱良春老先生的临床经验方，由生地、当归、淫羊藿等二十味中药组成.有显著的补肾化淤作用，能调节免疫功能并修复因RA因子引起的骨质破坏，临床效果良好，未见明显不良反应[1].张子伯等[2]报道了马兜铃酸A致中草药肾病的有关情况，由于本方中寻骨风含有马兜铃酸A，为了保障该制剂的安全性，我们对益肾蠲痹丸及所用药材中马兜铃酸A的限度进行了研究，并建立了检测灵敏度高、专属性强的高效液相色谱法.

目前文献报道的马兜铃酸含量测定方法主要有HPLC法、LC-MS法、TLCS法、毛细管电泳法等[3-4].本研究采用HPLC法，以分离度，最低检测限、定量限为指标，对提取方法进行了考察.

1 仪器试药及样品

PerkinElmer Flexar高效液相色谱仪；马兜铃酸A：购自中国药品生物制品检定所(批号：110746-200507)；甲醇为色谱纯；氢氧化钠、盐酸、冰醋酸均为分析纯；水为自制.样品120717、120718、120719.加入马兜铃酸A的阳性样品120722.

2 色谱条件

色谱柱：填料为 Diamonsil C18，5 μm， 4.6×250 mm不锈钢柱，迪马公司；流动相：甲醇-水-冰醋酸(69∶30∶1)；流速：1.0 mL /min；柱温：35 ℃；检测波长：250 nm.

3 溶液的制备

3.1对照品溶液的制备

精密称取马兜铃酸A对照品适量于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含马兜铃酸A11 μg/mL的溶液.

3.2供试品溶液的制备

取本品适量研细，取约5.0 g，精密称定，置100 mL圆底瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，用少量甲醇洗涤容器和滤器，洗液与滤液合并，回收溶液至干，残渣加0.1 mol/L氢氧化钠溶液30 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，弃去三氯甲烷液，药液再加5 mol/L盐酸调节pH至2，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣用70%甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

3.3阴性供试品溶液的制备

按本品处方及工艺制备寻骨风缺味样品，照供试品溶液的制备处理，作为阴性供试品溶液.

在按色谱条件2项下的条件，分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图.结果表明阴性供试品在马兜铃酸A色谱峰位置处无相应峰出现，与其相邻的其他成分色谱峰达到基线分离，对含量测定结果无影响；空白溶剂、对照品、样品和阴性供试品的HPLC图，见图1～4.

图1 空白溶剂色谱图

图2 对照品色谱图

图3 样品色谱图

图4 阴性供试品色谱图

4 实验条件的确定

4.1最大吸收波长，流动相的吸收度

取马兜铃酸A对照品溶液，在200～400 nm间进行紫外吸收光谱扫描，在389、318、250、223 nm处均有吸收峰.根据扫描结果，比较了对照品和供试品在320 nm与250 nm下检测的色谱图，发现在250 nm处检测灵敏度较高，且基线平稳.没有杂质干扰，因此，选择250 nm作为测定波长.

4.2柱效及拖尾因子测定

在选定色谱条件下，在样品测定中马兜铃酸A色谱峰的理论塔板数进行测定与计算，马兜铃酸A色谱峰的理论塔板n=11315，拖尾因子1.05 .

4.3线性范围的考察

精密称取马兜铃酸A对照品适量于量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含马兜铃酸A 0.011、0.022、0.055、0.110、0.165、0.330 μg/mL的溶液，分别进样10μL，记录峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标作图，得标准曲线，见图5；进样量在0.011～0.330 μg之间时，进样量与峰面积呈良好的线性关系. 标准曲线的回归方程Y=5 308 818Χ-4 676，相关系数r=0.999 9.

图5 马兜铃酸A标准曲线

4.4最低检测限

取质量浓度为1.1 μg/mL的马兜铃酸A对照品溶液，分别进样1～5 μL至信噪比等于3结果马

兜铃酸A的最低检测限为2.2 ng.

4.5精密度试验

取同一质量浓度对照品溶液，连续进样5次，每次10 μL，记录峰面积；结果见表.对照品平均面积为587 327，RSD为0.14%(n=5).

4.6稳定性试验

取对照品溶液10 μL，每隔2 h时间进样，结果见对照品平均面积为峰580 291，RSD=0.31%(n=5)；结果表明，对照品溶液室温放置8 h内稳定.

4.7重现性试验

取本品(120717批)，研匀，精密称取6份，每份5.0 g，按含量测定方法进行测定，结果马兜铃酸A均为检出(n=6).结果表明，重现性良好.

4.8加样回收率试验

取本品(120717批)约5.0 g，置100 mL圆底瓶中，加入质量浓度为0.110 8 mg/mL对照品贮备溶液1.2、1.5、1.8 mL，加入50 mL甲醇，照含量测定法处理，依法操作，制得9份供试品溶液，进样，测定，计算回收率.结果见表1.

表1回收率试验数据

称样量/g含被测量(A)/mg加入对照品(B)量/mg测定总量(C)/mg计算量(C-A)/mg回收率(C-A)/B/%5．0696未检出0．13300．13340．1334100．305．0711未检出0．13300．13090．130998．425．0796未检出0．13300．1320．13299．255．0636未检出0．16620．16310．163198．135．0117未检出0．16620．16370．163798．505．0573未检出0．16620．16630．1663100．065．0295未检出0．19940．19820．198299．405．0511未检出0．19940．19760．197699．105．0906未检出0．19940．20070．2007100．65

平均回收率99.31% ，RSD为0.89%(n=9).上述数据表明，加样回收率良好.

4.9耐用性实验

取120722批制剂5.0g，精密称定，按法处理，进行测定.

通过实验初步确定的色谱条件：流动相：甲醇-水-冰醋酸(69∶30∶1)；检测波长：250 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃.在此基础上，分别考察了流动相的配比、流动相酸度、柱温、流速及检测波长小有变动的情况下，对测量结果的影响程度.结果见表2.

表2耐用性实验

条件马兜铃酸的量/(ng·g-1)354．3柱温/℃374．2320．60．94．3流速/(mL·min-1)1．13．9波长/nm2602403．82．6流动相配比与酸度甲醇-水-冰醋酸(68∶31∶1)pH=3．544．6甲醇-水-冰醋酸(69∶30∶1)pH=3．554．3甲醇-水-冰醋酸(69∶29∶2)pH=3．403．6甲醇-水-磷酸(69∶30．5∶0．5)pH=2．47＿

结果显示：

1)流速对保留时间有影响，流速为1.1 mL/min主峰与前后杂质峰的分离度分别为1.32与1.16，阴性无干扰，对含量测定无影响；流速为0.9 mL/min与杂质峰的分离度为1.05，阴性无干扰，对含量测定无影响；所以流速控制在1.1～0.9 mL/min，对含量测定均无影响，最佳流速为1.0 mL/min.

2)37 ℃柱温对含量测定无影响，对保留时间改变不明显； 32 ℃柱温对含量测定有影响，含量较高；所以温度控制在35～37 ℃之间即可.

3)波长为260 nm峰面积较250 nm处小，阴性无干扰，对含量测定无影响；波长为240 nm峰面积与250 nm处无明显区别，但对含量测定有影响；所以波长选择250 nm最为适宜.

4)酸度对含量测定影响较大，阴性干扰严重，所以pH控制在3.5以上最为适宜.

5)提取方法的考察

提取方法参考了有关文献[4-7]，首先选择文献报道较多的提取方法进行实验.

取本品(120722批)，研匀，精密称取3份，每份5.0 g，分别采用甲醇回流、甲醇超声，甲醇回流三氯甲烷萃取的方法，按含量测定方法进行测定，结果见表3.

表3提取方法考察结果1

方法甲醇超声甲醇回流甲醇回流三氯甲烷萃取t/min303030结果有杂质干扰有杂质干扰无杂质干扰

以上结果表明，采用甲醇超声，甲醇回流提取的杂质较多，干扰马兜铃酸A的测定，故选择先甲醇回流后三氯甲烷多步提取的方法能较好的去除杂质，阴性无干扰.

5 回流时间与萃取次数的考察

实验1：取本品(120722批)，研匀，取约5.0 g，精密称定，置100 mL圆底瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流60 min，滤过，用少量甲醇洗涤容器和滤器，洗液与滤液合并，回收溶液至干，残渣加0.1 mol/L氢氧化钠溶液30 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，弃去三氯甲烷液，药液再加5 mol/L盐酸调节pH至2，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣用70%甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

实验2：取本品(120717批)，研匀，取约5.0 g，精密称定，置100 mL圆底瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流30 min，滤过，用少量甲醇洗涤容器和滤器，洗液与滤液合并，回收溶液至干，残渣加0.1 mol/L氢氧化钠溶液30 mL使溶解，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣用70%甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

实验3：将实验2的药液再加5 mol/L盐酸调节pH至2，用三氯甲烷振摇提取3次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣用70%甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

实验4：将实验3的药液再用三氯甲烷振摇提取2次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶液至干，残渣用70%甲醇溶解，并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得.

取上述溶液进行测定结果见表4.

表4提取方法考察结果2

实验号马兜铃酸A/(ng·g-1)19．2542未检出39．0174未检出

以上结果表明：

加热回流30 min与60 min对含量结果无明显影响，所以选择加热回流30 min即可；

在碱性环境下采用氯仿振摇提取3次，没有将马兜铃酸A提取出来，只去除了一部分杂质，达到了良好的除杂效果；

在酸性条件下了采用氯仿振摇提取3次，即可将马兜铃酸A提取完全，因为结果显示再用氯仿振摇提取4～5次中未检测出马兜铃酸A.

6 样品的测定

取5.0 g三批样品，批号为 120717、120718、120719的益肾蠲痹丸，按法测定，记录色谱图，三批制剂中均未检出马兜铃酸A.根据上述研究结果表明马兜铃酸A的最低检测限为2.216 ng，检测灵敏度较高，低于2.216 ng就视为未检出，说明本制剂是安全的.

近几年来，有很多文献报道了中成药中马兜铃酸A的限量检查，其中刘雅琳，高慧敏等[8]采用高效液相色谱法对市售的15批中成药样品中马兜铃酸A的含量进行了分析，15批中成药药中有7批含有细辛药材，4批含有木香药材，2批含有木通药材，1批含有防己药材，1批含有马兜铃药材，其中只有1批检出了马兜铃酸A，仅含1.95 μg/g，其余14批均未检出马兜铃酸A.这也客观地说明了对于某些确有疗效的中成药，是可以合理避免马兜铃酸A提取的.

[1] 彭 程, 李运曼,PERERA P K, 等. 益肾蠲痹丸对大鼠胶原性关节炎继发病变治疗作用的实验研究[J]. 中国医药科技, 2010, 17(5): 387-388, 390, 376.

[2] 黄文政. 含马兜铃酸的中药肾损害研究现状及对策[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2004, 5(4): 243-146.

[3] 张兰桐, 崔晓红, 袁志芳, 等. RP-HPLC法测定中药材及其制剂中马兜铃科药材中马兜铃酸A的含量[J]. 药物分析杂志, 2003, 23(3): 215-218.

[4] 周跃华, 周 娟, 黄莎莎, 等. 部分马兜铃科药材中马兜铃酸A的含量测定研究[J]. 药物分析杂志2008,28(7): 1075-1080.

[5] 任 薇, 李少华, 龙彦纲, 等. HPLC法检查新生颗粒中马兜铃酸A的含量[J]. 中药新药与临床药理, 2010, 21(1): 67-69.

[6] 俞 冰, 刘志承, 李曙光. 固本祛风颗粒中马兜铃酸I的限量检查[J]. 中国药房, 2011, 22(47): 4485-4486.

[7] 葛孝忠, 张跃平. 辛芩颗粒中马兜铃酸AHPLC法限度检查[J]. 中国医药工业杂志, 2010, 41(8): 604-606.

[8] 刘雅琳, 高慧敏. 微量马兜铃酸A检测方法的建立及其应用[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(24): 3314-3317.

HPLCdeterminationofaristolochicacidinYishenJuanbipill

WANG Chong-yi1, JUAN Hai-long1, LI Hao2

(1. Jiagsu Chiatai Qingjiang Pharmaceutical Co.,Ltd, Huai’an 223005, China； 2. Huai’an First People’s Hospital, Huai’an 223001, China)

To establish a sensitive and good reproducibility mehiod of determinating aristolochic acid A method for aristolochic acid A in Yishen Juanbi pill. RP-HPLC method was adopted. Diamonsil C18column, 5 μm, 4.6×250 mm was used. The mobile phase was methanol-water-acetic acid (69∶30∶1) at a flow rate of 1.0 mL/min, and the column temperature was 35 ℃. The UV-detection wavelength was 250 nm. The results suggested that under the range from 0.011 to 0.304 μg and the regression equationY= 5 308 818Χ-4 676, the recoveries (n=9) of the method was 99.31%. The method was accurate, sensitive, specific, and suitable.

aristolochic acid A; Yishen Juanbi pill; content determination; HPLC

2016-12-06.

王崇益(1976 -)，男，工程师，研究方向：药物分析.

R284

：A

1672-0946(2017)04-0406-05