郎 朗，郑洪权，李文昶，孙 嘉，白 晶，于 淼，季宇彬

(1. 哈尔滨商业大学 中药学博士后科研流动站，哈尔滨150076；2. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076)

关防风中残留有机氯农药提取测定方法优化研究

郎 朗1,2，郑洪权2，李文昶2，孙 嘉2，白 晶2，于 淼1,2，季宇彬1,2

(1. 哈尔滨商业大学 中药学博士后科研流动站，哈尔滨150076；2. 哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076)

为研究东北产地道药材关防风的有机氯农药残留现状，通过筛选提取溶剂、对比提取方法、选用L9(34)正交设计表优化提取条件，选择最佳净化方法，调整升温程序和载气流速确定最佳气相色谱条件，对关防风中6种有机氯农药的残留量进行分析研究.结果表明用丙酮和二氯甲烷的混合溶剂作为提取剂，通过超声波进行提取和浓硫酸磺化法进行净化，制备供试品溶液.该分析方法适用于能耐受强酸的有机氯农药，符合农药残留分析的要求，该方法简便快速，可以为其他中草药中有机氯农药残留量检测提供参考.

东北道地药材；关防风；有机氯农药；提取测定方法；优化

防风为伞形科植物(Saposhnikovia divaricata (Turcz.)Schischk.)的干燥根，为防治一切风邪所致疾病的要药，故名防风，东北三省的防风品质最好，称关防风，其药效确切，中医治疗需求量大[1].但中药中农药残留已成为影响其疗效、安全性的主要问题[2-3].有机氯农药作为一类广谱杀虫剂，曾被广泛用于农业生产中，但由于毒性大、残留量高，我国已于1983年禁止生产和使用，在禁用近30年后，在土壤和水体中的残留量仍然很高[4-6].本实验在查阅国内外大量相关文献的基础上，系统地对关防风中有机氯农药的含量测定方法进行了研究.采用混合有机溶剂超声提取，浓硫酸磺化对有机氯农药进行净化，通过气相色谱-电子捕获检测(GC-ECD)法进行含量测定，建立了关防风中有机氯农药的含量测定方法，并为性状类似的中药材中农药残留量的检测提供了参考.

1 仪器与试药

1.1实验仪器

6890N气相色谱仪(ECD检测器，美国Agilent公司)；7683自动进样器(美国Agilent公司)；JP-030ST型超声波清洗机(深圳市洁盟清洗设备有限公司).

1.2实验药品与试剂

正己烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)；石油醚(分析纯，60～90℃，天津市津东天正精细化学试剂厂)；丙酮(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)；二氯甲烷(分析纯，天津市福晨化学试剂厂) ；正己烷(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；石油醚(色谱纯，60～90℃，天津市光复精细化工研究所)；浓硫酸(优级纯，北京化工厂).

1.3标准品与供试样品

γ-六六六、p.p′-DDT、六氯苯、艾氏剂、七氯、反式氯丹，质量浓度为100 μg/mL，国家标准物质研究中心.

关防风药材采自大庆市让胡路区银浪江业中药材种植合作社.

2 实验方法与结果

2.1提取与净化条件的选择

2.1.1 提取方法的选择

关防风药材60 ℃干燥4 h，粉碎过五号筛，称取2.0 g后处理：

方法1：与10 g无水硫酸钠混匀，放入100 mL具塞锥形瓶内，加入60 mL丙酮-二氯甲烷(1+1)浸泡l2 h后，超声提取20 min.静置，过滤，收集滤液，残渣分别加入30 mL丙酮重复超声提取3次，合并滤液.

方法2：放入100 mL具塞锥形瓶内，加水20 mL浸泡过夜，精密加丙酮40 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用丙酮补足减失的质量，再加氯化钠约6 g及二氯甲烷30 mL，称定质量，超声处理15 min，再称定质量，用二氯甲烷补足减失的质量，静置(使分层)，将有机相迅速移入装有适量无水硫酸钠的100 mL具塞锥形瓶中，放置4 h.

由图1、2可见，方法1有机氯农药检测值明显高于方法2，方法1采用混合有机溶剂提取，方法2采用水提，根据有机氯农药性质，有机溶剂较水的提取效果好.

图1 方法1样品色谱图

图2 方法2样品色谱图

2.1.2 提取溶剂的选择

选择以下3种溶剂方案进行筛选：1)丙酮-正己烷(1+1)，2)丙酮-石油醚(1+1)，3)丙酮-二氯甲烷(1+1).称取关防风药材2.0 g，分别用以上3种溶剂方案进行超声提取，气相色谱测定见图3.结果表明：方案1)检测值偏低.方案2)检测值稍有提高，但提取杂质较多.方案3)提取效果最佳，检测值高，其中杂质色谱峰不干扰农药成分检测.因此采用方案3)丙酮-二氯甲烷(1+1)混合溶剂作为提取溶剂.

图3 提取剂比较色谱图

2.1.3 提取条件的优化

采用超声提取法，选取提取温度、提取时间和混合溶剂比例三个反应条件作为正交设计的3个因素，每个因素选取三个水平，选用L9(34)正交设计表，把其中一列作为空白列，对关防风中有机氯农药的提取条件进行优化，因素水平表见表1，试验方案及试验结果见表2，试验结果分析见表3，方差分析见表4.

表1正交设计因素水平表

水平(A)提取温度/℃(B)提取时间/min(C)溶剂比例12015丙酮-二氯甲烷(2+1)23020丙酮-二氯甲烷(1+1)34025丙酮-二氯甲烷(1+2)

表2试验方案及试验结果

试验号ABC空列γ-六六六的量/(μg·kg-1)p．p′-DDT的量/(μg·kg-1)六氯苯的量/(μg·kg-1)1111120．3223．749．652122235．4629．9615．893133346．0342．8327．344212329．5828．6713．815223141．7235．7317．266231242．9536．8220．057313237．5331．3616．738321334．8231．6313．419332147．9739．6926．38

表3试验结果分析

指标ABC空列γ-六六六的量/(μg·kg-1)K1101．8287．4298．10110．01K2114．24111．99113．01115．95K3120．33136．95125．28110．43k133．9429．1432．7036．67k238．0837．3337．6738．65k340．1145．6541．7636．81极差R6．1716．519．061．98因素主次BCA优方案B3C3A3p．p′-DDT的量/(μg·kg-1)K196．5483．7692．1999．15K2101．2297．3298．3198．13K3102．69119．34109．92103．14k132．1827．9230．7333．05k233．7432．4432．7732．71k334．2339．7836．6434．38极差R2．0511．865．911．66因素主次BCA优方案B3C3A3六氯苯的量/(μg·kg-1)K152．8940．2043．1153．28K251．1246．5656．0752．68K356．5273．7761．3254．57k117．6313．4014．3717．76k217．0415．5218．6917．56k318．8424．5920．4418．19极差R1．8011．196．070．63因素主次BCA优方案B3C3A3

表4方差分析

指标方差来源离差平方和(SS)自由度(df)方差F值显著性γ-六六六的量/(μg·kg-1)A59．36229．688．13B408．712204．3655．99∗C123．61261．8116．93误差7．3023．65p．p′-DDT的量/(μg·kg-1)A6．8823．441．49B214．862107．4346．38∗C54．05227．0311．67误差4．6322．32六氯苯的量/(μg·kg-1)A5．0622．538．17B212．062106．03342．59∗C58．64229．3294．73∗误差0．6220．31

注：F0.05(2,2)=19.00.

对于这3种有机氯农药，各因素对其提取效果的影响趋势一致，且各因素的主次顺序一致.农药检测值与提取时间和提取温度成正比，并随着二氯甲烷添加比例的增大而提高，但当提取时间大于20 min，二氯甲烷在混合溶剂中的添加比例大于50%时，随着提取时间和二氯甲烷添加比例的增大，引入的杂质量也明显增大，干扰了待测组分的测定，因此确定提取条件为：提取温度为40 ℃；提取时间为20 min；提取溶剂为丙酮-二氯甲烷(1+1).

2.1.4 净化方法的选择

对两种浓硫酸磺化的净化方法进行筛选，具体步骤如下(见图4)：

方法1：将提取液40 ℃水浴减压浓缩至近干，加少量正己烷如前反复操作至二氯甲烷及丙酮除净，用正己烷溶解并转移至10 mL刻度离心管中，加正己烷至5 mL.小心加入硫酸1 mL，振摇1 min，离心(3 000 r/min)10 min.取上清液，即得样品净化液.

方法2：将提取液加入已有250 mL无水硫酸钠溶液的分液漏斗内，振摇1 min，静置分层，去水相，收集有机相.将有机相移入分液漏斗内，加30 mL浓硫酸，振摇，静置分层，除去硫酸相.如有机相有颜色需重复操作.再加入250 mL无水硫酸钠溶液于分液漏斗中，振摇，静置分层，除去水相，重复3次，直至有机相呈中性.收集有机相浓缩至近干，用正己烷定容至5 mL，作为样品净化液，待测定.

图4 净化方法比较色谱图

方法1检测值高于方法2，且简便快速，具有很好的净化效果，对提取液中农药含量的影响也较小.因此选择方法1作为净化方法.

2.1.5 色谱条件的选择

方案1)：初始温度110 ℃，以15 ℃/min的速率升至205 ℃，以5 ℃/min的速率升至220 ℃，以25 ℃/min的速率升至270 ℃，以5 ℃/min的速率升至280 ℃，保持1.67 min.载气流速为1.0 mL/min.色谱图见图5.

方案2)：初始温度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min速率升至200 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升至280 ℃，保持2 min.载气流速为1.0 mL/min.色谱图见图6.

方案3)：初始温度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min速率升至200 ℃，保持2 min，以8 ℃/min速率升至280 ℃，保持2 min.载气流速为2.5 mL/min.色谱图见图7.

从图7中可知，方案3提高了载气流速，分离度较前两种方案好，检测结果更加准确，同时也缩短了分离时间.因此选择方案三作为色谱分离的优化条件.

图5 方案1)色谱图

图6 方案2)色谱图

图7 方案3)色谱图

确定色谱条件：Agilent弹性石英毛细管柱HP-5(30 m×0.32 mm× 0.25 μm)；进样口温度：290 ℃；检测器温度：300 ℃；柱升温程序：初始温度100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min的速率升至200 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至280 ℃，保持2 min；载气为高纯氮气(>99.999%)，载气流速为2.5 mL/min(恒流方式)；采用不分流进样方式；进样量为1.0 μL；外标法定量.

2.1.6 标准曲线的绘制

用正己烷将γ-六六六、p.p′-DDT、六氯苯、艾氏剂、七氯、反式氯丹，配成10 μg/mL储备液.分别取1 mL储备液，定容至10 mL得混合对照品储备液.精密吸取各质量浓度的混合对照品溶液，按确定色谱条件进行测定，连续进样3次，取3次平均值，以质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线结果见表5.

表5有机氯农药的回归方程、相关系数及线性范围

农药保留时间/min回归方程相关系数(r)线性范围/(μg·L-1)γ-六六六10．05y=384841x-6279740．99965～250p．p′-DDT12．06y=848959x-15137680．99985～100六氯苯9．67y=7394751x-61543160．99942～100艾氏剂12．53y=1285014x-13274580．99955～200七氯11．68y=1901233x-2649450．99985～200反式氯丹14．39y=1592395x-27324290．99915～200

结果表明：γ-六六六、p.p′-DDT、六氯苯在5～100 μg/L的质量浓度范围内线性关系良好，艾氏剂、七氯、反式氯丹在5～200 μg/L的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 1.

2.1.7 方法学考察

1)精密度试验 精密吸取10 μg/L的混合对照品溶液，色谱测定，连续进样5次，根据峰面积计算，得出：γ-六六六、p.p′-DDT、六氯苯、艾氏剂、七氯、反式氯丹峰面积值的RSD(%)分别为4.2、3.2、4.3、3.8、6.5、3.0.结果表明该方法精密度良好.

2)重现性试验

准确称取关防风样品5份，每份2.0 g，制备供试品溶液，色谱测定，根据标准曲线计算药材中农药残留量，得出：γ-六六六、p.p′-DDT、六氯苯农药残留量的RSD(%)分别为6.2、2.5、5.5，艾氏剂、七氯、反式氯丹均未检出.结果表明该方法重现性良好.

3)回收率试验

准确称取关防风样品9份，每份2.0 g，按低、中、高三个水平添加混合对照品溶液，每水平3份样品，制备加样回收供试品溶液，色谱测定，根据标准曲线计算6种有机氯农药的回收率和相对标准偏差，结果见表6.图8.

表6有机氯农药的回收率及相对标准偏差(n=3)

农药ⅠⅡⅢ平均回收率/%RSD/%平均回收率/%RSD/%平均回收率/%RSD/%γ-六六六92．87．095．37．498．78．7p．p′-DDT97．35．597．44．998．07．1六氯苯95．47．399．75．596．55．9艾氏剂92．83．089．14．789．93．9七氯86．17．188．34．691．94．2反式氯丹83．55．884．45．691．34．1

Added(添加量)：Ⅰ：15 μg/kg；Ⅱ：30 μg/kg；Ⅲ：60 μg/kg

2.1.8 样品的测定

取关防风药材，制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液，用10 μg /L的混合对照品溶液作随行对照，色谱测定，连续进样3次，取3次平均值.以峰面积外标法定量，得关防风中有机氯农药的残留量.

关防风药材中γ-六六六的残留量为42.35 μg/kg，p.p′-DDT的残留量为35.83 μg/kg，六氯苯的残留量为21.67 μg/kg，艾氏剂、七氯和反式氯丹均未检出.见图9.

图8 6种有机氯农药混合对照品色谱图

图9 关防风样品色谱图

3 结 语

本实验建立了关防风药材中有机氯农药残留量的气相色谱测定方法.该分析方法适用于能耐受强酸性物质的有机氯农药，符合农药残留分析的要求.该方法简便快速，成本低，选择性好，同时具备回收率高，重现性好的特点，可以为其他中草药中有机氯农药残留量的检测提供参考.

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StudyonoptimizationofextractionanddetectionmethodforresidualorganochlorinepesticidesinSaposhnikoviadivaricata

LANG Lang1,2,ZHENG Hong-quan2, LI Wen-chang2, SUN Jia2, BAI Jing2,YU Miao1,2, JI Yu-bin1,2

(1. Post-doctoral Research Station of Pharmacy, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Center of Research on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

To study on the status of organochlorine pesticide residues in northeast authentic medicinal herbs Saposhnikovia divaricata. The extraction conditions were optimized by screening extraction solvent, extraction method and orthogonal design. The residual amount of six kinds of organochlorine pesticides in Saposhnikovia divaricata was analyzed through choosing the best way to clean up, adjusting the temperature rise procedure and the carrier gas flow rate to determine the optimum chromatographic conditions. The results showed a mixed solvent of acetone and methylene chloride were used as extraction agent, by ultrasonic extraction and concentrated sulfuric acid sulfonation method for purification to prepare the test solution. The analysis method is suitable for strong acid tolerance, and meets the requirements of pesticide residue analysis. This method was simple and rapid. It could provide reference for the detection of organic chlorine and other pesticide residues in Chinese herbal medicines.

northeast authentic medicinal herbs; Saposhnikovia divaricata; organochlorine pesticides; extraction and detection method; optimization

2017-01-19.

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12541188)

郎 朗(1979-)，女，博士，副研究员，研究方向：药理与毒理.

R282

：A

1672-0946(2017)04-0385-05