朱振标 张 寿 沈 慧 林之斌 丁晓莉 刘亦恒

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

葛根总黄酮对去卵巢大鼠骨组织γ-氨基丁酸信号通路的影响

朱振标 张 寿 沈 慧 林之斌 丁晓莉 刘亦恒

(海口市人民医院骨科中心，海南 海口 570208)

目的观察葛根总黄酮对去卵巢大鼠骨组织γ-氨基丁酸(GABA)信号通路的影响。方法选用雌性大鼠45只，分为假手术组15只和手术组30只，手术组行双侧卵巢切除术，造模12 w时测定骨密度(BMD)，确认骨质疏松(OP)复制成功后，将手术组大鼠又随机分为模型组和葛根总黄酮组，每组均15只；葛根总黄酮组大鼠给予葛根总黄酮灌胃，持续时间为12 w，模型组和假手术组同时给予等量生理盐水灌胃；实验结束后测定大鼠的BMD，ELISA法观察血清谷氨酸脱羟酶(GAD)水平，免疫组化法观察股骨远端GABA、GABA受体(GABABR)1和GABA转运蛋白(GAT)1的表达，RT-PCR法检测股骨GABABR1 mRNA表达情况。结果在造模12 w时，与假手术组比较，手术组大鼠第5、6腰椎、肱骨近侧干骺端、股骨近侧干骺端、股骨远侧干骺端的骨组织BMD值出现了下降(P<0.05)；给药结束后，与模型组相比较，假手术组和葛根总黄酮组大鼠血清GAD水平、股骨GABA、GABABR1的表达均显著降低(P<0.05)；给药结束后，与模型组比较，假手术组和葛根异黄酮组大鼠股骨GABABR1 mRNA表达均降低(P<0.01或P<0.05)。结论葛根总黄酮防治OP的机制之一可能是通过降低血清GAD水平、减少股骨GABA和GABABR1含量及GABABR1 mRNA表达实现的。

葛根总黄酮；骨质疏松；γ-氨基丁酸信号

骨质疏松(OP)发病中，女性明显高于男性〔1～3〕，这是因为绝经后雌激素水平降低是导致女性发病的主要原因。防治绝经后OP的主要方法是雌激素替代疗法，但临床中发现其容易引起癌变及其他副作用。植物雌激素的化学结构与雌激素非常相似，可发挥拟雌激素或抗激素效应。葛根总黄酮是葛根的主要有效成分，具有类似于植物雌激素的作用，且毒副作用低微，可作为雌激素的替代品长期服用，避免了雌激素的致癌作用。本实验观察葛根总黄酮对去卵巢大鼠骨组织γ-氨基丁酸(GABA)信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 选用清洁级、3月龄、雌性SD大鼠，共45只，体重(180±20)g，购自长沙市天勤生物技术有限公司〔许可证号：SCXK(湘)2009-0012〕。

1.2主要实验药物及试剂 葛根总黄酮粉(有效成分含量为40%)；GABA受体(GABABR)1多克隆抗体(英国Abcam公司生产)；谷氨酸脱氢酶(GAD)ELISA试剂盒(美国R&D公司生产)；免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物有限公司)；GABA转运蛋白(GAT1)多克隆抗体(英国Abcam公司生产)；GABA多克隆抗体；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物公司生产)；RT-PCR检测试剂盒(大连宝生物有限公司生产)。

1.3主要实验仪器及设备 双能X线骨密度仪(美国Lunar公司，Prodigy型)；高速冷冻离心机(2-16K，德国Sigma公司)；显微镜(日本OLYMPUS公司)；酶标仪(680型，美国BIO-RAD公司)；梯度PCR仪(Veriti 96-Well，美国ABI公司)；凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司，GELEQ)；电子天平(ACS-3C型，广州中山市新和基科技开发有限公司生产)。

1.4实验方法

1.4.1实验分组 大鼠分笼饲养，自由摄取标准饲料，饮用自来水，适应性饲养1 w后按随机数字表法将45只大鼠随机分为假手术组15只、手术组30只。假手术组大鼠行腹腔手术找到卵巢，但不切除，手术组大鼠行双侧卵巢切除术。所有动物饲养12 w后检测骨密度(BMD)，以确定OP动物模型复制成功是否，若成功后即将30只手术组大鼠再随机分为模型组、葛根总黄酮组各15只。

1.4.2制作OP模型 OP模型制作参照文献中的方法〔4〕，切除双侧卵巢制作大鼠OP模型。将称重后的各组大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg，行全身麻醉后取仰卧位，固定后进行腹部剃毛并消毒，沿下腹部正中腹白线作纵行切口(切口长度2～3 cm)，打开腹腔后即切除双侧卵巢，术后切口用75%酒精棉球消毒。假手术组亦打开腹腔，但不切除卵巢。术后为预防感染各组大鼠腹腔注射10万U青霉素3 ml/只，1次/d，连续3 d。

1.4.3BMD测定 术后第12周，手术组和假手术组大鼠行全身麻醉后测定BMD。测定部位为第5、6腰椎、肱骨近侧干骺端、股骨近侧干骺端、股骨远侧干骺端。股骨近侧干骺端为股骨近侧1/4，肱骨近侧干骺端为肱骨近侧1/4，股骨远侧干骺端为股骨远侧1/4。

1.4.4给药方法 模型复制成功后，给药组大鼠用葛根总黄酮灌胃50 mg·kg-1·d-1。将药物稀释成1.0 ml/100 g，体重5 mg/ml后即进行灌胃，1次/d(灌胃前12 h应禁食不禁水，持续12 w)。同时假手术组和模型组用等量生理盐水灌胃。

1.4.5标本采集 灌胃12 w后处死大鼠，腹腔内注射2%戊巴比妥钠40 mg/kg，心脏采血，离心后取血清，置-20℃备用。再依次灌注生理盐水200～250 ml、4%多聚甲醛350～400 ml。灌注完以上液体即取左侧股骨，用DEPC水处理后，密封包裹保存于液氮中；取出右侧股骨，在4℃条件下用4%多聚甲醛中固定24 h。

1.4.6血清GAD含量测定 ELISA法按试剂盒说明书进行操作。

1.4.7免疫组化法检测GABA、GABABR1和GAT1 按试剂盒说明书进行操作，应用Image-ProPlus6.0医学图像分析软件进行半定量分析〔5〕，测量免疫阳性部位的平均光密度。

1.4.8RT-PCR法检测GABABR1 mRNA的表达 引物的设计以GAPDH为对照，大连宝生物有限公司合成,RT-PCR方法见参考文献〔6〕。GAPDH上游5'-ACCACAGTCCAIGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'；GABABR1上游5'-AGCTGACCAGACCTTGGTCAT-3'，下游5'-AACTGGCTTCTCCCTATGTGTGG-3'。

1.5统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，方差齐时采用Tukey检验，方差不齐时采用DulmettT3检验。

2 结 果

2.1一般情况 实验结束时可能由于手术、麻醉等原因，一部分大鼠出现死亡，死亡分布情况为：假手术组大鼠死亡1只；模型组死亡2只；葛根总黄酮组死亡1只。给药一段时间后，发现模型组大鼠体态臃肿，皮毛发黄，欠光泽，反应迟缓，而假手术组和葛根总黄酮组大鼠则皮毛光泽，反应敏捷。

2.2各组大鼠不同部位BMD测定 手术12 w后，与假手术组比较，手术组大鼠全身多个部位出现BMD降低。其中左股骨远端和右肱骨近端、右股骨远端、5～6腰椎、右股骨近端、左股骨近端等部位BMD值差异显著(P<0.05，P<0.01)，说明手术组大鼠骨量明显丢失，提示OP模型复制成功，见表1。

2.3各组大鼠血清GAD表达 给药结束后，和模型组大鼠比较〔(33.01±5.08)pmol/L〕，假手术组〔(22.88±4.32)pmol/L〕和葛根总黄酮组〔(21.36±4.45)pmol/L〕大鼠血清中GAD值均显著增高(P<0.05)，假手术组、葛根总黄酮组GAD值比较无差异(P>0.05)。

表1 手术12 w时各组各部位BMD水平比较(±s，g/cm2，n=14)

与假手术组比较:1)P<0.01，2)P<0.05

2.4骨组织GABA、GABABR1、GAT1的表达 免疫组化结果显示，与模型组比较，假手术组和葛根总黄酮组大鼠骨组织GABA、GABABR1平均光密度均降低(P<0.05)，但假手术组和葛根总黄酮组之间骨组织GABA、GABABR1平均光密度比较无差异(P>0.05)。与模型组比较，假手术组和葛根总黄酮组大鼠骨组织GAT1的平均光密度均降低，但无显著差异(P>0.05)，假手术组和葛根总黄酮组之间亦无差异(P>0.05)，见表2。

2.5骨组织GABABR1 mRNA表达 RT-PCR检测表明，与模型组(0.750 3±0.031)大鼠比较，假手术组骨组织GABABR1 mRNA的表达显著降低(0.623 2±0.036，P<0.01)，葛根总黄酮组大鼠骨组织GABABR1 mRNA的表达亦降低(0.678 1±0.044，P<0.05)，但假手术组和葛根总黄酮组两者之间无差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠骨组织GABA、GABABR1、GAT1蛋白含量平均光密度比较(±s)

与模型组比较:1)P<0.05

3 讨 论

GABA信号通路由谷氨酸、GAD、GABA-T、GABA、GABAR、GAT等组成〔7，8〕。GABA是哺乳动物神经系统中最丰富和功能最重要的抑制性神经递质，以GABA为递质的中枢突触部位约占50%，GABA在生物体内具有重要的生理功能，参与多种神经生理活动，已报道其具有调节血压、促进脑部血流、营养神经细胞、预防肥胖、促进乙醇代谢、改善更年期综合征等生理活性〔9～11〕。有学者等〔9〕通过研究有如下发现：①GABA能促进生长激素(GH)分泌，而生长激素具有促进软骨、骨骼、肌肉结缔组织增长、促进身体许多组织RNA及蛋白质合成的作用。②GH具有增加软骨中胶原和硫酸软骨素、其他蛋白质、核酸合成，促进肝脏等组织合成胰岛素生长因子(IGF)的作用。IGF是骨组织中含量较丰富的生长因子，它能刺激成骨细胞(OB)增殖、分化，增殖前体成骨，增多功能性OB的数目等。

OP的临床表现主要为患者骨量明显下降，易发骨折，同时可能还伴有严重的骨痛，其主要是由骨重建高转换而引起的。女性绝经后出现明显的OP多由于缺乏雌激素而引起骨重建高转换的。本实验结果说明了OP模型大鼠骨组织内GABA信号处于一种高表达水平，由于模型组大鼠骨量严重丢失，由此推断GABA信号的高表达是为了对抗骨量的丢失。而葛根总黄酮可以较好地治疗OP，使OP模型大鼠的骨量增加，降低了成骨的迫切性，使神经系统的调节作用减缓，减少了GABA及相关物质的释放。推测当GABA在身体内大量聚集但又不能及时被转运的情况下，GABA可能是通过GABABR抑制葛根总黄酮或许能够通过GABA抑制OB活性这种途径治疗OP，这可能是葛根异黄酮治疗OP的机制之一。

1郑 青,梁 宁.老年性骨质疏松患者血清细胞因子水平与 OPG/RANKL/RANK 轴的相关性〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(17):3651-3.

2褚建国,王季军.骨质疏松骨代谢的 OPG/RANKL/RANK 作用机制〔J〕.中国老年学杂志,2013;33(10):5015-7.

3刘 苹,胡 萍,邢凤霞,等.中老年人骨密度分析及骨质疏松患病率〔J〕.中国老年学杂志,2013；33(10)：5139-40.

4Devlin HF,Erguson MW.Compositional changes in the rat femur following ovariectomy〔J〕 Act Anatomic,1989;136(1):38-41.

5Franeiso JS,Moraes HP,Dias EP.Evaluation of the Image Pro Plus4.5 software for automatic counting of labeled nuclei by pcA immunohistochemistry〔J〕.Bra Oral Res,2004;18(2):100-4.

6Yin JL,Shackel NA,Zekry A,etal.Realtime reverse transcriptase poly-merase chain reaction(RT-PCT)for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorogenic probes or SYBR Green I〔J〕.Immunol Cell Biol,2001;79(3):213-21.

7吕辰鹏.骨碎补总黄酮对去卵巢大鼠骨组织GABA信号通路的影响〔D〕.广州：暨南大学,2011.

8刘志广.腺苷A1受体在癫痫发病机制中的作用及其与GABA信号通路相关性的研究〔D〕.武汉：华中科技大学,2013.

9林亲录,王 婧,陈海军.γ-氨基丁酸的研究进展〔J〕.现代食品科技,2008;24(5):496-500.

10张滢滢,屈 强,唐显玲.神经递质参与精神兴奋药物成瘾的研究进展〔J〕.重庆医学,2011;40(4)：392-4.

11赵 晖,王 蕾,张秋霞,等.竹节参总皂苷对血管痴呆大鼠递质氨基酸及自由基代谢的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010;30(11):3096-8.

〔2015-08-29修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

海南省自然科学基金(No.811156)；海南省卫生厅资助项目(No.琼卫2010-69)

刘亦恒(1976-)，男，博士，副主任医师，主要从事骨质疏松及脊柱脊髓损伤研究。

朱振标(1981-)，男，硕士，主治医师，主要从事骨质疏松及骨关节疾病研究。

R28

A

1005-9202(2017)16-3940-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.014