郝 鑫 张 刚 李 中

(河北大学附属医院肿瘤外科，河北 保定 071000)

乳腺浸润性导管癌组织中p-AKT的表达

郝 鑫 张 刚 李 中

(河北大学附属医院肿瘤外科，河北 保定 071000)

目的探讨人乳腺浸润性导管癌组织内p-AKT的功能和作用。方法对100例乳腺浸润性导管癌组织和30例正常乳腺组织内p-AKT蛋白及mRNA的表达情况进行Western印迹和RT-PCR检测。结果乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中p-AKT蛋白及mRNA的表达有显著差异(P<0.05)；p-AKT蛋白及mRNA在乳腺癌不同临床分期中表达存在统计学差异(P<0.05)。结论p-AKT的表达与乳腺浸润性导管癌的发生及临床病理相关，可作为一个新的评价乳腺癌预后的指标。

乳腺癌；p-AKT；Western印迹；RT-PCR

AKT是一种Ser/Thr蛋白〔1〕，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路中的重要分子，而p-AKT是Akt的活化形式。PI3K/AKT信号通路参与了许多生理及病理过程，包括调节细胞周期及肿瘤的血管生成，其通过影响其下游多个效应分子的活化状态而发挥作用。本文观察乳腺浸润性导管癌组织p-AKT的表达。

1 材料与方法

1.1研究对象 河北大学附属医院病理科2010年1月至2013年5月100例临床手术切除乳腺癌标本，年龄35～78岁，平均(48.35 ± 5.14)岁。30例正常乳腺组织(即与标本对应的位于癌边缘≥5 cm处的癌旁组织)，年龄36～72岁，平均(40.52 ± 5.13)岁。在手术之后进行的常规腋淋巴结检查中，每位病例检取>10枚的淋巴结，常规石蜡包埋制成4 μm厚切片以方便对免疫组织的化学染色。为开展后续的RT-PCR和Western印迹检测法，对乳腺癌新鲜组织进行收集，液氮保存。

1.2试剂及器械 兔抗人p-AKT单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)、AMV第一链cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)、引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)、β-actin一抗(鼠抗人单克隆抗体)〔美国赛默飞世尔科(InvitrogenTM)〕、β-actin二抗(山羊抗鼠多克隆抗体)(美国 KPL公司)、紫外分光光度仪〔美国beckman公司(DU800)〕、酶标仪MK3〔雷勃公司(Thermo labsystems)〕、DYY-6B型稳压稳流电泳仪(上海信然实业有限公司)、PTC-220-PCR扩增仪(美国Research 公司)2020D紫外荧光数字成像仪(GoldSpring产品)。

1.3Western印迹操作方法 -80℃下新鲜保存乳腺癌组织取1份，适量(50～80 mg)选取乳腺良性病变组织1份。剪碎后，在匀浆器内添加400 μl单去污剂裂解液(含PMSF)，4℃ 12 000 r/min离心5 min后，去上清后用Eppendorf管进行分装，至于-20℃进行保存。对BCA工作液内的蛋白浓度进行测定，分别配置12%分离胶以及5%浓缩胶，在泳道边缘加1倍上样缓冲液，接80 V电压电极至浓缩胶，在分离胶时将电压上调至120 V直至带染料的蛋白质到分离胶底部处即可停止。结束电泳之后，按照目的蛋白分子量对胶体进行切割，转膜2 h。在装有5%脱脂奶粉封闭液的盒体中加入转好的PVDF膜，置于4℃摇床上封闭2 h；杂交袋中倒入杂交膜，再倒入已过稀释的一抗工作液于37℃孵化培育2 h或者过夜，三次TBST洗膜分别耗时15、10、10 min。按1∶5 000的比例对二抗进行稀释，1 h到时后TBST洗膜倒入稀释的二抗，3次事件均为5 min；显影再定影。用p-AKT/ β-actin灰度值来代表P-AKT蛋白的相对表达,灰度经过Quantity One 软件进行分析工作。

1.4RT-PCR操作方法 对p-AKT片段扩增至196 bp，其中p-AKT引物序列如下：正义链：5'-GTGCTGGAGGACAATGACT ACGG-3'；反义链:5'-AGCAGCCCTGAAAGCAAGGA-3'。β-actin片段扩增(250 bp)，引物序列：正义链:5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3'；反义链:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。在冰浴之下剪碎100 mg取于液氮内保存后置于匀浆器的组织，立即倒入1 ml预冷后的Trizol提取液，进行匀浆工作。再将匀浆液倒入1.5 ml Eppendorf管中，静置5 min。对总RNA进行提取和检测纯度工作。如果 OD260/280比值1.8～2.0，说明RNA无降解现象及无蛋白污染。取0.3 μg总RNA作为模板进行逆转录成cDNA。逆转录的反应条件：30℃，10 min；42℃，30 min；99℃，5 min；5℃，5 min。逆转录的反应体系为10 μl。对p-AKT扩增的反应条件如下：于94℃下预变性2 min；94℃下进行变性30 s，59℃下进行30 s退火 ，1 min 72℃延伸 ，在进行30次循环；10℃ 10 min延伸。对4%琼脂糖凝胶。进行45 min 120 V的电泳。使用ZF型的紫外透射反射分析仪进行摄像工作，使用Quantity one4.62版软件统计各条带的积分光密度值，通过积分光密度值的比值对各样本组间差异进行定量分析。

1.5统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1p-AKT蛋白与mRNA在乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中的表达 Western印迹检测结果表明：正常乳腺组织中p-AKT蛋白的相对表达量是0.37±0.08，明显低于癌组织(0.79±0.15，P<0.05)。RT-PCR结果表明：在正常乳腺组织中，p-AKT mRNA的相对表达量是0.35±0.17，显著小于癌组织(0.78±0.16，P<0.05)。两方法结果一致。见图1，图2。

2.2p-AKT蛋白及mRNA与乳腺癌临床病理特征关系 乳腺浸润性导管癌中，p-AKT蛋白及mRNA表达水平与临床分期有关(P<0.05)。淋巴结转移组织分级与年龄和肿瘤直径无关(P>0.05)。见表1。

表1 p-AKT蛋白及mRNA与乳腺癌临床病理学特征的关系(±s)

3 讨 论

多种途径或方法可显著激活PI3K〔2,3〕,活化后的PI3K继续激活可与细胞内的信号蛋白相结合；以活化底物 PIP2和PIP3来作为第二信使，逐级进行激活工作，最后，形成信号级联复合物，通过对在 Thr308 和Ser473 位点的磷酸化而激活AKT。PI3K/AKT信号通路在肿瘤的产生和发展扩大的过程里扮演着不可忽视的角色。AKT，同源于能致小老鼠得白血病的病毒癌基因v-AKT 所编码出得癌蛋白，很多因素会在其活化的过程中产生影响作用，如激素、生长因子和细胞因子等〔4〕。下游的分子会在激活的AKT作用下展开的细胞的增殖、分化乃至炎症过程〔5〕。并且，此通路中任一信号分子表达上升或者下调都会导致肿瘤细胞的死亡，增殖以及侵袭等等方面的特殊情况发生。肺癌组织中AKT表达高水平，且与肺癌的分化程度以及淋巴结转移情况、TNM 分期息息相关〔6〕。Zhang等〔7〕采用免疫组化以及荧光定量对11例正常小肠组织和53例小肠腺癌组织进行检测出后发现，在小肠腺癌癌变组织内的PI3K/AKT信号通路被高度活化，表明PI3K/AKT信号通路可作为临床潜在治疗靶点〔7〕。彭雅亚〔8〕对PI3K/AKT信号通路在乳腺癌 、癌旁正常组织、乳腺纤维腺瘤中的表达情况进行了检测和研究之后发现PI3K/AKT信号通路是乳腺癌产生和发展的重要可能诱因。恶性肿瘤在不断的转化过程中AKT身影不可忽视，活化之后的AKT经由细胞存活信号的释放，使其下游靶蛋白磷酸化，抑制或激活，下游靶蛋白分子有Bad，caspase-9及 Forkhead等〔9,10〕。其中Bad来源于Bcl-2家族，能使细胞凋亡。在生理状态下，Bad 结合 Bcl-xl形成复合物发挥出促进凋亡的功能，而活化的AKT促使Bad磷酸化最终会妨碍复合物的形成，中止凋亡的发生〔11〕。caspase-9经AKT活化后，对细胞色素C诱导的半胱天冬酶活化有着抑制的功能。Ser183 和 Ser196是处于caspase-9上两个AKT磷酸化的位点，尤其Ser196具有重要作用，AKT对caspase-9磷酸化后，降低了其蛋白酶活性进而弱化其促进凋亡的功能。Forkhead家族对多种凋亡因子的表达具有诱导作用，而AKT则经磷酸化Forkhead家族磷间接由转录调节对其凋亡过程产生抵制和弱化作用。本文结果表明PI3K/AKT信号通路在乳腺癌的产生和发展过程中发挥着重要功能。

1Maira SM，Finan P，Garcia-echeverria C.From the bench to the bed side:PI3K pathway inhibitors in clinical development〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol,2010;347:209-39.

2Shaw RJ，Cantley LC.Ras，PI(3) K and mTOR signaling controls tumour cell growth〔J〕.Nature，2006;441(7092):424-30.

3Katso R，Okkenhaug K，Ahmadi K，etal.Cellular function of phosphoinositide 3-kinases:implications for development，homeostasis，and cancer〔J〕.Ann Rev Cell Dev Biol，2001;17:615-75.

4李 建,周怀君.PI3K/Akt 信号通路在肿瘤研究中的进展〔J〕.东南大学学报(医学版),2014;33(3):392-5.

5Maira SM，Finan P，Garcia-Echeverria C.From the bench to the bed side:PI3K pathway inhibitors in clinical development〔J〕.Curr Top Microbiol Immunol，2010;347:209-39.

6万 军,车 云,康宁宁.信号通路蛋白 Akt1 ERK1/2与 HIF-1 在肺癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.实用癌症杂志2014;29(12):1515-21.

7Zhang Y，Yao X，Jiang C，etal.Expression of PI3K，PTEN and Akt in small intestinal adenocarcinoma detected by quantum dots-based immunofluorescence technology〔J〕.Cancer Biomark，2013;13(4):299-305.

8彭雅亚.在乳腺良恶性病变中的表达及其临床意义〔J〕.长沙医学院学报,2014;12(3):19-22.

9Quan JH,Cha GH,Zhou W,etal.Involvement of PI3kinase/Akt -dependent Bad phosphorylation in Toxoplasmagondi imediated inhibition of host cell apoptosis 〔J〕.Exp Parasitol,2013;133(4):462-71.

10Vu NT,Park MA,Shultz JC,etal.hnRNP U enhances caspase-9 splicingan dismodulated by AKT-dependent phosphorylation of hnRNP L〔J〕.J Biol Chem,2013;288(12):8575-84.

11刁存启，毕经旺，王宝成.Akt 信号分子和结直肠癌的关系〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2014;21(5):584-8.

〔2016-03-04修回〕

(编辑 曹梦园)

河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究计划项目(361007)；2017年河北大学“河北省研究生创新资助项目”(X201738)

李 中(1966-)，男，硕士，主任医师，硕士生导师，主要从事乳腺肿瘤学研究。

郝 鑫(1990-)，女，硕士，主要从事乳腺肿瘤研究。

R73

A

1005-9202(2017)16-3938-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.013